劉素梅，方忠意，王麗，張躍京，臧合英，李慧素

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450002)

四環(huán)素類抗生素是20 世紀40年代發(fā)現(xiàn)的一類具有菲烷(母核)的廣譜抗生素，該類抗生素廣泛應(yīng)用于革蘭陽性和陰性細菌、支原體和立克次氏體等引起的感染[1]。四環(huán)素片收載在《獸藥質(zhì)量標準》(2017年版)化學藥品卷中，含量測定采用微生物檢定法，該方法操作較繁瑣，試驗周期長，影響因素多，結(jié)果重復(fù)性差，擬采用簡便高效的高效液相色譜法，對四環(huán)素含量進行測定。

1 材 料

1.1 儀器設(shè)備 Waters高效液相色譜系統(tǒng)：包括2695分離系統(tǒng)、2489紫外檢測器、Empower2色譜工作站；METTLER XS205電子天平；MILIPORE超純水處理器等。

1.2 試藥試劑 鹽酸四環(huán)素對照品購自中國食品藥品檢定研究院，液相用甲醇、乙腈為色譜純試劑，磷酸二氫鉀為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 標準工作液的制備 精密稱取鹽酸四環(huán)素對照品50 mg，置50 mL量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液適量，振搖使溶解，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻；臨用前用0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋成濃度為10、20、50、100、200和500 μg/ml的標準工作液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量(相當于四環(huán)素0.05 g)，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL，振搖使溶解，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻；精密量取上清液5 mL，置25 mL量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻。

2.1.3 提取方法的考察 四環(huán)素在水中微溶，與鹽酸結(jié)合生成鹽酸四環(huán)素后溶于水[1-2]，所以先用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，再用0.01 mol/L鹽酸溶液進行稀釋[3-4]，分別考察了直接稀釋、超聲提取10 min和超聲提取20 min的提取效果。四環(huán)素用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解效果優(yōu)于0.01 mol/L鹽酸溶液溶解；振搖溶解提取效果優(yōu)于超聲提取效果，原因可能是四環(huán)素不穩(wěn)定，在超聲過程中降解的原因。所以采用0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL振搖溶解，再用0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋的提取方法。

2.2 色譜條件的選擇 查閱相關(guān)文獻，先后考察了0.1 mol/L磷酸氫二銨-乙腈[5]、0.01 mol/L十二烷基硫酸鈉溶液-乙腈[6]、0.1 mol/L草酸銨-二甲基甲酰胺-0.2 mol/L磷酸氫二銨[7-8]、甲醇-0.05 %庚烷磺酸鈉溶液-三乙胺[9]、乙腈-水-甲酸[10]等系統(tǒng)，結(jié)果四環(huán)素與其他雜質(zhì)分離度不好，并且四環(huán)素峰前延；后采用《中國藥典》2015年版二部鹽酸四環(huán)素含量測定所用流動相[2]：醋酸銨溶液[0.15 mol/L醋酸銨溶液-0.01 mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺(100∶10∶1)，用醋酸調(diào)節(jié)pH值至8.5]-乙腈(83∶17)，四環(huán)素峰前延，對稱因子為0.8065，并且基線噪音大。后采用0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)pH值至2.0)-甲醇(88∶12)，四環(huán)素峰形、柱效及分離度均滿意，所以采用該系統(tǒng)作為流動相。

《中國藥典》2015年版二部鹽酸四環(huán)素含量測定項下檢測波長為280 nm，所以本研究也采用280 nm作為檢測波長，最終色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)pH值至2.0)(12∶88)為流動相；柱溫為40℃；檢測波長為280 nm。

2.3 線性與范圍 按2.1.1項下方法制備系列濃度標準工作溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度與相應(yīng)的組分峰面積算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，回歸方程為：y=1803x+4150，相關(guān)系數(shù)r=0.99999，即在10～500 μg/ml范圍內(nèi)，四環(huán)素具有良好的線性，結(jié)果見圖1。

圖1 四環(huán)素標準曲線圖Fig 1 Standard curve of Tetracycline

2.4 準確度 取空白輔料0.02 g，共取6份，精密稱定，分別加入四環(huán)素原料50 mg，混勻。按照2.4.1.2項下供試品制備方法進行處理，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以加入的同批四環(huán)素原料為對照，同法測定，按外標法以峰面積計算，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，該試驗回收率高，準確度好，可以準確測定四環(huán)素含量。

表1 回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab 1 Results of recovery tests(n=6)

2.5 精密度 取四環(huán)素片樣品20片，精密稱定，研細，精密稱取細粉0.07 g，共6份，按2.4.1.2項下供試品制備方法進行處理，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，結(jié)果乘以0.9242，即得含量，計算RSD，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該試驗重復(fù)性良好。

表2 精密度試驗結(jié)果(n=6)Tab 2 Results of precision tests(n=6)

2.6 專屬性 經(jīng)過考察，四環(huán)素片在生產(chǎn)過程中使用輔料為淀粉和硬脂酸鎂，我們模擬生產(chǎn)工藝，配制了含0.2 %硬脂酸鎂的淀粉進行壓片，作為空白樣品。稱取研細后的空白樣品0.02 g，按2.4.1.2項下供試品制備方法進行處理，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，空白無干擾，見圖2～圖5。

圖2 四環(huán)素對照品(100 μg/mL)色譜圖Fig 2 Chromatogram of Tetracycline reference substance (100 μg/mL)

圖3 四環(huán)素片樣品色譜圖Fig 3 Chromatogram of Tetracycline Tablets

圖4 空白樣品陽性添加色譜圖Fig 4 Chromatogram of positive control sample

圖5 空白樣品色譜圖Fig 5 Chromatogram of negative sanple

2.7 溶液穩(wěn)定性 取精密度項下的一個樣品，分別在0，1，2，6，10和12 h進樣，考察樣品穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 耐用性 取四環(huán)素對照品溶液，在不同柱溫、不同pH值下進行測定，以及采用不同的色譜柱，對該方法的耐用性進行考察。

2.8.1 不同柱溫的考察 考察了30 ℃、40 ℃和50 ℃等溫度下，對四環(huán)素的影響。從結(jié)果看，不同柱溫下，四環(huán)素峰形及柱效均達到滿意效果，但隨著溫度的降低，色譜峰展寬嚴重，所以柱溫定為40 ℃。

2.8.2 不同pH值的考察 流動相中0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液的pH值對色譜峰影響很大，考察了2.0、2.5和3.0三個不同pH值下的四環(huán)素色譜峰，分別稱取4-差向四環(huán)素對照品、鹽酸四環(huán)素對照品和土霉素對照品，配制成每1 mL含各組分均為0.1 mg/mL的混合對照品溶液進樣。pH值2.5和3.0時峰形對稱性變差，且四環(huán)素與土霉素的分離度降低。考慮到柱子的耐用性，流動相pH值不能過低，所以采用2.0。

2.8.3 不同柱子的考察 分別考察了Waters Xbridge C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)、phenomenex Gemini C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)和Agela Venusil MP C18(3 μm，4.6 mm×150 mm)四種色譜柱，取2.8.2項下混合對照品溶液進樣。四種色譜柱在柱效和分離度上都能滿足檢測需求。

2.9 樣品測定 按2.1.2項下供試品溶液制備方法進行處理，進高效液相色譜儀分析，按外標法以峰面積計算四環(huán)素的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果Tab 3 Results of contents determination of samples

3 討 論

3.1 現(xiàn)行四環(huán)素片質(zhì)量標準中含量測定采用的微生物檢定法 該方法操作繁瑣，試驗周期長，影響因素多，結(jié)果重復(fù)性差，經(jīng)驗證，本試驗建立的高效液相色譜法方法簡單、專屬強、準確度高、重現(xiàn)性好，適用于四環(huán)素片的含量測定。

3.2 目前中國食品藥品檢定研究院提供的只有鹽酸四環(huán)素對照品 無四環(huán)素對照品。四環(huán)素分子式為C22H24N2O8，分子量為444.43，鹽酸四環(huán)素分子式為C22H25ClN2O8，分子量為480.9，所以用鹽酸四環(huán)素對照品測定四環(huán)素含量，計算結(jié)果需乘以系數(shù)0.9242。

3.3 四環(huán)素和鹽酸四環(huán)素的溶解性不同 所以進行準確性驗證時，采用四環(huán)素原料做添加回收試驗，經(jīng)驗證，回收率為100.03%。

3.4 試驗所用的四環(huán)素片含量偏低 原因可能是該樣品質(zhì)量問題，也可能是按照現(xiàn)行質(zhì)量標準測定含量合格，按照本方法測定含量不合格。