張玉潔，沈昕，李丹，李倩，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

阿維菌素類藥物化學結(jié)構(gòu)新穎，作用機制獨特，殺蟲活性強，殺蟲譜廣，因而被廣泛應(yīng)用于牛、羊等動物。2020年4月1日生效的GB 31650-2019規(guī)定，阿維菌素禁用于泌乳期牛、羊，在牛羊組織中的最大殘留限量(MRL)為20～100 μg/kg；伊維菌素在牛奶中的最高殘留限量為10 μg/kg，在牛、羊、豬組織中的MRL為30～100 μg/kg；多拉菌素在牛奶中的MRL為15 μg/kg，在牛、羊、豬組織中的MRL為5～150 μg/kg；乙酰氨基阿維菌素在牛奶中的MRL為20 μg/kg，牛肌肉等組織中MRL為100～2000 μg/kg[1]。對比之前的農(nóng)業(yè)部第235號公告，GB31650對阿維菌素類藥物最主要的變化一是取消了多拉菌素泌乳期的禁用限制，制定了其在牛奶中的MRL，二是增補了乙酰氨基阿維菌素的限量規(guī)定[2]。阿維菌素類藥物是目前獸醫(yī)臨床上用量最大的抗寄生蟲藥物，而其在奶、奶粉及動物組織中的殘留也會對消費者健康產(chǎn)生不利影響。

目前阿維菌素類藥物主要采用高效液相色譜法[3～16]和液相色譜-質(zhì)譜法[8]進行分析。雖然阿維菌素分子結(jié)構(gòu)中具有共軛二烯結(jié)構(gòu)， 能在245 nm處有強的紫外吸收，但紫外檢測法的選擇性和靈敏度不能滿足要求。80年代后，熒光衍生化檢測成為阿維菌素殘留檢測的主要研究方向。經(jīng)過de Montigny等人[4]的研究摸索和逐步改善，基本確定了N-甲基咪唑和三氟乙酸酐作為衍生化試劑，乙腈作為反應(yīng)溶劑。發(fā)展至目前，各具體方法的衍生化步驟存在差異，不同方法的檢測限、定量限也有很大差別。

與液相色譜-質(zhì)譜法相比，高效液相色譜法具有儀器普及率高、成本低、操作簡單、基質(zhì)影響小，定量準確等特點。而相比于其他的禁用藥物，阿維菌素類藥物衍生化后的熒光響應(yīng)值很高，雜質(zhì)干擾很少，很適合用高效液相色譜法進行定量檢測。因此，本研究在對比現(xiàn)行標準衍生化方法的基礎(chǔ)上，詳細研究了時間、溫度及光照條件對衍生化產(chǎn)物的影響，從而制定了衍生化程度最充分、用時最短、操作最簡便的衍生化方法，并且將這一衍生化方法應(yīng)用于牛奶、羊奶、奶粉及豬、牛的肌肉、肝臟等組織的檢測，實踐效果良好。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備、試劑及對照品 Agilent 1100高效液相色譜儀(配熒光檢測器)；SPE柱：Bond Elut C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)；固相萃取裝置；氮吹儀；高速冷凍離心機；Milli-Q超純水儀等。

阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿維菌素對照品，純度≥91.0%，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。甲醇、乙腈、無水乙醇為色譜純，異辛烷、三乙胺為分析純。試驗用水為符合國家標準的一級水。

1.2 溶液配制 衍生化試劑A液：N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)?，F(xiàn)用現(xiàn)配。B液：三氟乙酸酐-乙腈(1+2，v/v)。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 試驗方法

1.3.1 液相色譜條件：色譜柱： C18250 mm × 4.6 mm (i.d.)，粒徑5 μm； 流動相∶乙腈：水(90∶10,V/V)；流速: 1.8 mL/min；檢測波長：激發(fā)波長365 nm；發(fā)射波長475 nm；柱溫：40 ℃；進樣量: 40 μL。

1.3.2 衍生化步驟 洗脫液氮氣吹干后，向試管中依次加入衍生化試劑A液100 μL和B液150 μL，密閉，渦動10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 μL，渦動10 s。衍生化反應(yīng)后加650 μL甲醇混勻。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜檢測。

1.3.3 測定溫度對衍生化產(chǎn)物的影響 取100 ng/mL的阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿維菌素混合標準工作液1 mL至玻璃試管中，50 ℃氮氣吹干后按照1.3.2步驟加入衍生化試劑和催化反應(yīng)液。制備三組樣品，常溫組14個樣品，另外兩組各12個樣品。上述樣品分別置于常溫、50 ℃和65 ℃恒溫箱中避光反應(yīng)。并分別于0、15、30、45、60、75及100 min時間點從各組取出兩個平行樣品加入甲醇后上機測定。

1.3.4 測定光照對衍生化產(chǎn)物的影響 取100 ng/mL的阿維菌素類藥物混合標準工作液1 mL至玻璃試管中，50 ℃氮氣吹干后按照1.3.2步驟加入衍生化試劑和催化反應(yīng)液。設(shè)置兩組樣品，每組2個平行樣，一組用棕色試管置于黑暗密閉條件下反應(yīng)，另一組用透明試管置于實驗室明亮光照條件下反應(yīng)。兩組均在常溫下反應(yīng)75 min，加入甲醇后上機測定。

1.3.5 組織樣品衍生化測定步驟 奶及奶粉的樣品前處理過程見張玉潔等的試驗方法[5]。與之相比，豬、牛肌肉、肝臟的前處理過程略有差異：稱取試料(5±0.05) g， 8 mL乙腈作為提取溶劑提取兩次，同時，離心管中加入不銹鋼珠2粒防止組織凝聚抱團，之后的凈化濃縮步驟同奶及奶粉中[5]的相關(guān)步驟。

洗脫液氮氣吹干后，按照1.3.2步驟加入衍生化試劑和催化反應(yīng)液，65℃密閉避光反應(yīng)15 min，取出后加650 μL甲醇混勻。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化條件的溫度-時間曲線 根據(jù)平行樣品的峰面積平均值及對應(yīng)溫度和時間點繪制了反應(yīng)曲線圖(圖1)如下。

圖1 溫度和反應(yīng)時間對阿維菌素類藥物衍生化效果的影響Fig 1 The derivatization effect of the avermectins under various temperature and duration time

2.2 光照對衍生化反應(yīng)的影響 在實驗室明亮光照和避光兩種條件下的色譜圖如下(圖2)，結(jié)果顯示明亮光照下四種藥物的峰面積均明顯低于避光條件下的衍生化產(chǎn)物峰面積。

注：紅色為避光條件下4種阿維菌素類藥物衍生化反應(yīng)的色譜圖，藍色為實驗室明亮光照下4種阿維菌素類藥物的色譜圖。圖2 光照對衍生化反應(yīng)的影響Fig 2 The effect of light on the derivatization

2.3 奶、奶粉及豬、牛組織樣品的測定 牛奶、羊奶、奶粉及豬、牛的肌肉和肝臟樣品經(jīng)衍生化后用熒光檢測器進行測定，以信噪比(S/N)≥10，且在該添加水平的回收率和變異系數(shù)均滿足殘留分析要求的最小濃度作為定量限(LOQ)。經(jīng)測定乙酰氨基阿維菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素在牛奶、羊奶組織中的定量限為0.5 μg/kg；在豬、牛的肌肉、肝臟及奶粉中的定量限為5 μg/kg。羊奶空白樣品、標準溶液及0.5 μg/kg添加樣品衍生化色譜圖如下(圖3A、B、C)：

3 討論與結(jié)論

3.1 阿維菌素類藥物衍生化測定現(xiàn)狀 對阿維菌素類藥物的衍生化試劑普遍使用N-甲基咪唑-乙腈和三氟乙酸酐-乙腈進行[3～15]，不過不同方法間衍生化反應(yīng)條件有所差異，反應(yīng)溫度、時間跨度較大。現(xiàn)有國家標準GB 29696-2013[6]和程林麗等[7]的研究均以牛奶為基質(zhì)，其衍生化反應(yīng)在室溫進行，時長30 min。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告1025號—5—2008《動物性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測——酶聯(lián)免疫吸附法，高效液相色譜法和液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》測定了牛肝臟、肌肉和豬肝臟中的4種阿維菌素類藥物，其衍生化反應(yīng)在96 ℃下反應(yīng)100 min[8]。農(nóng)業(yè)部公告781號—5—2006《動物源食品中阿維菌素類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》[9]和王海等人[10]測定了動物組織中阿維菌素、伊維菌素和多拉菌素三個藥物，其衍生化反應(yīng)在室溫瞬間進行。魏廣智等[11]認為阿維菌素類藥物在室溫下衍生化反應(yīng)15 min達到峰值，反應(yīng)時間太短或過長都影響產(chǎn)率。謝顯傳等人[12]研究了阿維菌素的熒光反應(yīng)影響因素，認為溫度對其衍生化反應(yīng)影響不大，衍生化反應(yīng)對光線敏感，反應(yīng)在30 min左右達到峰值。Ali等人[13]曾研究了5種阿維菌素類藥物的熒光衍生化反應(yīng)條件和動態(tài)，結(jié)果顯示阿維菌素、伊維菌素和莫西克丁的反應(yīng)產(chǎn)率瞬間可達峰值，此后逐漸降低。而乙酰氨基阿維菌素在室溫下要7 h才能達到峰值，若在65℃下反應(yīng)90 min產(chǎn)率最高。

注：1-乙酰氨基阿維菌素，2-阿維菌素，3-多拉菌素，4-伊維菌素圖3 羊奶樣品色譜圖Fig 3 The chromataograms of goat's milk

由此可見，目前阿維菌素類藥物的衍生化方法各異。經(jīng)本試初步驗摸索，豬、牛組織、牛羊奶和奶粉的提取液經(jīng)過C18固相萃取柱凈化濃縮后，在室溫下衍生化反應(yīng)15或30 min并不充分，將進樣溶液立即進樣與存放數(shù)小時后再進樣所得的乙酰氨基阿維菌素色譜峰面積相差較大，說明在放置過程中試樣溶液中的殘留藥物和衍生化試劑仍在繼續(xù)進行衍生化反應(yīng)。此現(xiàn)象用Ali等人[13]的研究結(jié)果可以應(yīng)證。

3.2 反應(yīng)溫度、時間及光照對衍生化產(chǎn)物的影響從本實驗對衍生化反應(yīng)溫度及時間的研究結(jié)果可以看出：反應(yīng)若在室溫下進行，阿維菌素、多拉菌素及伊維菌素經(jīng)過15-30 min，衍生化反應(yīng)基本可以完成，而乙酰氨基阿維菌素則需75 min以上反應(yīng)才能進行完全。衍生化反應(yīng)若在加熱條件下進行，65℃反應(yīng)15 min，四種藥物的衍生化即可充分完成。這其中，阿維菌素的反應(yīng)規(guī)律又與其他三種藥物略有差別：65℃下反應(yīng)超過70min，其產(chǎn)物含量不升反降。綜合四種藥物的溫度-時間反應(yīng)曲線來看，室溫反應(yīng)75 min或者65℃反應(yīng)15 min都可以獲得較好的衍生化效果。

而本實驗結(jié)果顯示在實驗室明亮光照和避光兩種條件下，前者四種藥物的峰面積均明顯低于后者。由此可見，在反應(yīng)溫度和時間一定的前提下，光照對衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性影響很大，應(yīng)盡量避光反應(yīng)。

綜合考慮4種藥物的反應(yīng)效率以及試驗時長的問題，本實驗確定衍生化反應(yīng)條件為65℃避光反應(yīng)15 min。此反應(yīng)條件下的衍生化反應(yīng)效率高、反應(yīng)充分，并且反應(yīng)后的衍生產(chǎn)物加入甲醇后形成的醇式衍生物含量穩(wěn)定，反應(yīng)結(jié)束后立即進樣與存放24 h后再進樣所得的檢測組分的峰面積相差無幾。

3.3 奶、奶粉及豬、牛組織的檢測 經(jīng)過衍生化條件的優(yōu)化，4種阿維菌素類藥物在牛奶和羊奶中的定量限可降低至0.5 μg/kg，在豬、牛組織及奶粉中的定量限可達到5 μg/kg。與現(xiàn)有國家標準GB 29696-2013[6]、GB/T 22968-2008[8]和其他的液相色譜法[7、9～11]的研究相比，應(yīng)用該衍生化方法后，四種阿維菌素類藥物的定量限更低，更能符合檢測需求。