徐宏軍，張凌云，侯野，姜磊，董婷婷，鄭杰，張乾順，馬寧寧*

(1.青島蔚藍(lán)生物制品有限公司，山東青島 266114；2.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東青島 266114;3.北京鼎持生物技術(shù)有限公司，北京 100176)

雞新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒引起的雞的一種急性、高度接觸性、烈性、病毒性傳染病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害極大，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為對(duì)動(dòng)物危害最大的A類傳染病之一。該病的主要特征是呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血[1-2]。易感雞群一旦被速發(fā)性噬內(nèi)臟型新城疫病毒所傳染，可迅速傳播并呈毀滅性流行，發(fā)病率和死亡率可達(dá)90%以上。新城疫首先于1926年于英國(guó)的新城發(fā)現(xiàn)，該疾病傳播迅速，2010年在80個(gè)國(guó)家中證實(shí)有NDV感染的病例。在2002～2003年間，由于美國(guó)加利福尼亞州暴發(fā)新城疫，撲殺的禽類達(dá)300萬只，直接經(jīng)濟(jì)損失超過1.6億美元[3]；2009～2010年間，新城疫疫情使得印度尼西亞商品雞的死亡率達(dá)到了70%～80%[4]。在中國(guó)，從1946年通過病毒分離證實(shí)了新城疫在我國(guó)的存在和流行，就不斷有禽類感染的報(bào)道。直到新城疫弱毒株的發(fā)現(xiàn)和新城疫弱毒疫苗(Hitchner B-1和La Sota)的應(yīng)用開啟了新城疫防控的新紀(jì)元，使得新城疫的傳播得到了一定程度的控制。在我國(guó)，使用低毒力活疫苗和油佐劑滅活疫苗已成為養(yǎng)禽業(yè)防治雞新城疫的常規(guī)措施。目前國(guó)內(nèi)雞新城疫疫苗的生產(chǎn)主要依靠傳統(tǒng)的“雞胚法”工藝實(shí)現(xiàn)。此工藝大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)存在雞胚質(zhì)量不穩(wěn)定及潛在外源病毒污染問題，收獲完成后，廢胚難于無害化處理，存在散毒風(fēng)險(xiǎn)和污染環(huán)境問題。以轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備疫苗的方法雖然克服了上述缺點(diǎn)，卻存在細(xì)胞生長(zhǎng)過程不易控制、病毒效價(jià)難以提高、收獲過程復(fù)雜，大規(guī)模生產(chǎn)勞動(dòng)強(qiáng)度大，勞動(dòng)效率低等劣勢(shì)[5]。

無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗屬于第三代疫苗生產(chǎn)方式，已應(yīng)用于禽流感和圓環(huán)等病毒的懸浮培養(yǎng)[6-7]。該技術(shù)具有容易放大、細(xì)胞培養(yǎng)基不含有血清成分(可避免由于血清批次不穩(wěn)定，外源病毒污染和嚴(yán)重免疫反應(yīng)等問題)、自動(dòng)化程度高、抗原培養(yǎng)滴度高等諸多優(yōu)點(diǎn)。而目前新城疫疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)仍以雞胚培養(yǎng)為主，新城疫的細(xì)胞培養(yǎng)大多數(shù)還停留在貼壁培養(yǎng)水平，本研究擬對(duì)BHK貼壁細(xì)胞進(jìn)行懸浮馴化，以獲得能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)并滿足新城疫大規(guī)模生產(chǎn)要求的懸浮細(xì)胞。并應(yīng)用生物反應(yīng)器系統(tǒng)對(duì)全懸浮培養(yǎng)條件下影響新城疫病毒La Sota株病毒產(chǎn)量的關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行了摸索、優(yōu)化和確定；用獲得的NDV La Sota株細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)放大，以期為該工藝后續(xù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與毒種 BHK-21細(xì)胞由北京鼎持生物技術(shù)有限公司提供。雞新城疫病毒La Sota株由青島蔚藍(lán)生物制品有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基和新生牛血清均購自GIBCO公司，BHK105、BHK106培養(yǎng)基由壹生科(深圳)有限公司提供，TPCK胰酶購自Sigma公司。

1.1.3 主要設(shè)備 5 L生物反應(yīng)器Sartorius stedim(賽多利斯)Biostat?A、16 L生物反應(yīng)器，購自廣州齊志生物工程設(shè)備有限公司；50 L生物反應(yīng)器購自上海奧星制藥技術(shù)裝備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細(xì)胞的懸浮馴化 復(fù)蘇1支BHK-21細(xì)胞，用含10%新生牛血清MEM培養(yǎng)基按常規(guī)方法傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，用含2%新生牛血清BHK105培養(yǎng)基將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至0.5×106cells/mL，并轉(zhuǎn)移至搖瓶中，連續(xù)傳代至細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，細(xì)胞密度大于2×106cells/mL，活率>95%，認(rèn)為BHK-21細(xì)胞已適應(yīng)低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期已適應(yīng)低血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞接種于無血清懸浮培養(yǎng)基BHK105中，初始密度為0.5×106cells/mL連續(xù)傳代至細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，細(xì)胞密度大于2×106cells/mL，活率>95%，認(rèn)為BHK-21細(xì)胞已適應(yīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，命名為“BHK-21-sc”。

1.2.2 BHK-21-sc細(xì)胞增殖的穩(wěn)定性 取馴化后細(xì)胞，調(diào)整初始密度0.5×106cells/mL，連續(xù)傳代20代，每72 h取樣測(cè)定細(xì)胞密度和細(xì)胞活率，對(duì)細(xì)胞傳代穩(wěn)定性進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1.2.3 BHK-21-sc懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線 在5 L生物反應(yīng)器中按照起始細(xì)胞密度0.5×106cells/mL、溶氧DO為40%、攪拌速度為150 r/min、pH為7.0，溫度為37 ℃的培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行3個(gè)批次的BHK-21-sc的懸浮培養(yǎng)168 h，每24 h取樣進(jìn)行細(xì)胞密度和細(xì)胞活率測(cè)定，并繪制BHK-21-sc懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.4 雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養(yǎng)工藝研究 按照BHK-21-sc懸浮培養(yǎng)工藝培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行NDV La Sota株的懸浮培養(yǎng)工藝研究。①接毒量及收獲時(shí)間：分別按MOI 0.0001、0.001、0.005、0.01接種雞新城疫病毒La Sota株，分別于48、60、72、84、96 h收獲病毒液；②TPCK胰酶添加量：添加終濃度為3、5、7、9 μg/mL TPCK胰酶進(jìn)行病毒增殖；③培養(yǎng)溫度：接毒后培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為30、33、37 ℃，確定最佳病毒培養(yǎng)溫度。在優(yōu)化各參數(shù)時(shí)，其他對(duì)應(yīng)參數(shù)固定不變。收獲的NDV病毒液進(jìn)行HA和TCID50效價(jià)檢測(cè)，以確定最佳病毒培養(yǎng)工藝參數(shù)。

1.2.5 雞新城疫病毒LaSota株懸浮培養(yǎng)工藝驗(yàn)證 在5 L反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞，密度達(dá)到6.0×106cells/mL以上，按照優(yōu)化后確定的病毒接種量、TPCK胰酶添加量和病毒培養(yǎng)溫度進(jìn)行病毒懸浮培養(yǎng)，按優(yōu)化后確定的病毒收獲時(shí)間，收獲病毒液并進(jìn)行HA、TCID50測(cè)定。按上述操作重復(fù)培養(yǎng)3批，驗(yàn)證該工藝的穩(wěn)定性。

1.2.6 新城疫La Sota株懸浮培養(yǎng)逐級(jí)放大工藝研究與驗(yàn)證 以優(yōu)化好的BHK-21-sc細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝在5 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行BHK-21-sc細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)72 h，待細(xì)胞密度達(dá)到要求后，按生物反應(yīng)器常規(guī)轉(zhuǎn)罐技術(shù)操作，轉(zhuǎn)入16 L生物反應(yīng)器進(jìn)行二級(jí)培養(yǎng)72 h，細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到要求后，部分細(xì)胞轉(zhuǎn)入50 L生物反應(yīng)器進(jìn)行三級(jí)培養(yǎng)，剩余細(xì)胞按優(yōu)化確定的新城疫La Sota株懸浮培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行病毒培養(yǎng)。當(dāng)50 L生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)72 h，進(jìn)行病毒培養(yǎng)，培養(yǎng)參數(shù)與16 L反應(yīng)器一致，收獲病毒液測(cè)定病毒含量。按照以上方法重復(fù)開展3批新城疫La Sota株懸浮培養(yǎng)，進(jìn)行逐級(jí)放大工藝驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞馴化及傳代 貼壁培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞用低血清細(xì)胞培養(yǎng)基在125 mL搖瓶中在進(jìn)行連續(xù)傳代6～8代后逐步適應(yīng)，生長(zhǎng)速度逐步變快，倍增時(shí)間逐步規(guī)律，細(xì)胞密度可達(dá)2×106cells/mL以上，獲得了適應(yīng)低血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21懸浮細(xì)胞。將已適應(yīng)低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的BHK-21懸浮細(xì)胞，用無血清細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代8～10代后逐步適應(yīng)，生長(zhǎng)速度逐步變快，倍增時(shí)間逐步規(guī)律，獲得了適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21懸浮細(xì)胞，將之命名為BHK-21-sc細(xì)胞。BHK-21-sc細(xì)胞呈圓形、飽滿、光滑，輪廓清晰、大小均一，分布均勻，培養(yǎng)液清亮，均為單一細(xì)胞，未見結(jié)團(tuán)現(xiàn)象(圖1)。圖1中a為貼壁培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，b為初始低血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，c為適應(yīng)低血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，d為初始無血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，e為適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21-sc細(xì)胞。

圖1 細(xì)胞馴化不同階段細(xì)胞狀態(tài)圖(100×)Fig 1 cell domestication at different stages (100×)

2.2 BHK-21-sc懸浮細(xì)胞增殖的穩(wěn)定性 為驗(yàn)證該馴化細(xì)胞的穩(wěn)定性，將馴化后細(xì)胞按初始密度0.5×106cells/mL連續(xù)傳20代，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，培養(yǎng)72 h細(xì)胞密度均在5×106cells/mL以上，細(xì)胞活率大于95%。穩(wěn)定性結(jié)果見圖2。

圖2 BHK-21-sc懸浮細(xì)胞增殖的穩(wěn)定性Fig 2 Stability of BHK-21-sc suspension cell proliferation

2.3 BHK-21-sc細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線 在5 L生物反應(yīng)器上，對(duì)BHK-21-sc細(xì)胞株培養(yǎng)168 h，繪制BHK-21-sc細(xì)胞株的懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明：3批次細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞密度均可達(dá)到6.0×106cells/mL以上，細(xì)胞活率均達(dá)97%以上，證明該懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，能夠滿足BHK-21-sc細(xì)胞株的懸浮培養(yǎng)工藝需求，結(jié)果見圖3。

圖3 BHK-21-sc細(xì)胞株在5 L生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)曲線Fig 3 Growth curve of BHK-21-sc cell line in 5L bioreactor

2.4 接毒量及收獲時(shí)間的優(yōu)化 分別以不同MOI接種La Sota株，接毒后48 h開始不同時(shí)間取樣繪制4批病毒增殖曲線。曲線圖可見接毒后72 h，病毒效價(jià)達(dá)到最高峰，隨后病毒滴度逐漸下降。接毒劑量MOI=0.005和MOI=0.01時(shí)培養(yǎng)72 h，病毒滴度相當(dāng)，但較其他組病毒含量高，考慮生產(chǎn)實(shí)際的效率與成本問題，本試驗(yàn)確定最佳接種和收獲條件為以MOI=0.005的接種量接種培養(yǎng)72 h收獲病毒液。結(jié)果見圖4。

圖4 不同接毒量接種BHK-21-sc細(xì)胞不同收獲時(shí)間的病毒含量測(cè)定Fig 4 Virus titers of BHK-21-sc cells inoculated with different dose at different harvest time

2.5 TPCK胰酶添加量的優(yōu)化 以MOI=0.005接毒，添加不同的胰酶量后培養(yǎng)72 h進(jìn)行病毒效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果表明TPCK胰酶終濃度為5 μg/mL時(shí)，收獲抗原HA為9log2，病毒含量為106.17TCID50/0.1mL，較其他胰酶添加量接種的病毒滴度高。確定5 μg/mL的TPCK胰酶濃度為最佳添加胰酶濃度。結(jié)果見表1。

表1 不同TPCK胰酶添加量接毒的病毒產(chǎn)量比較Tab 1 Comparison of viral production withdifferent TPCK trypsin dosage

2.6 接毒后培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 以不同培養(yǎng)溫度進(jìn)行病毒增殖，由病毒增殖結(jié)果可見，30 ℃和37 ℃較33 ℃病毒增殖效果差，故確定33 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。結(jié)果見表2。

2.7 雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養(yǎng)工藝驗(yàn)證 利用前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化獲得的最優(yōu)懸浮培養(yǎng)工藝參數(shù)組合，進(jìn)行3批次病毒懸浮培養(yǎng)，驗(yàn)證雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養(yǎng)工藝的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：3批次懸浮培養(yǎng)病毒液HA均不低于9log2，病毒含量均不低于106.13TCID50/0.1mL，證實(shí)建立的雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養(yǎng)工藝科學(xué)、可靠、穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

表3 雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養(yǎng)工藝重復(fù)性驗(yàn)證Tab 3 Repeatability verification of suspension culturetechnology of NDV La Sota strain

2.8 雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養(yǎng)工藝放大 用5L-16L-50L反應(yīng)器對(duì)BHK-21-sc細(xì)胞進(jìn)行逐級(jí)放大培養(yǎng)，放大工藝中3批細(xì)胞增殖曲線較為接近，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定。雞新城疫病毒La Sota株在16、50 L中經(jīng)3批次的培養(yǎng)，72 h后，收獲病毒液，HA滴度均可達(dá)9log2，病毒含量均可達(dá)106.0TCID50/0.1mL以上，與5 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)效果基本一致，說明雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養(yǎng)工藝可穩(wěn)定逐級(jí)放大到16、50 L生物反應(yīng)器，工藝重復(fù)性好、科學(xué)穩(wěn)定。結(jié)果見圖5、表4。

圖5 5、16、50 L生物反應(yīng)器內(nèi)BHK-21-sc細(xì)胞的增殖曲線Fig 5 Proliferation curves of BHK-21-sc cell in 16L and 50L bioreactors

表4 16、50 L生物反應(yīng)器內(nèi)工藝放大病毒增殖結(jié)果Tab 4 Amplification results of virus proliferation in 16 L and 50 L bioreactors

3 討論與結(jié)論

我國(guó)獸醫(yī)生物制品行業(yè)多采用雞胚接種收獲尿囊液的方式制備新城疫抗原，但雞胚接種制備疫苗抗原存在諸如雞胚來源不固定、有外源病毒污染可能等因素，而無血清懸浮培養(yǎng)可以有效提高單位體積內(nèi)的細(xì)胞量，并能夠增加批次間的穩(wěn)定性，是目前抗原培養(yǎng)的發(fā)展方向。應(yīng)用新型現(xiàn)代化的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝制造動(dòng)物疫苗抗原也是當(dāng)前我國(guó)動(dòng)物疫苗的主流發(fā)展趨勢(shì)之一。BHK細(xì)胞是指幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞(Baby Hamster Syrian Kidney)，1961年建株，它廣泛用于增殖各種病毒，生產(chǎn)獸用疫苗。通過優(yōu)化懸浮BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng)工藝能夠使其達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的水平[8]，BHK-21懸浮細(xì)胞已應(yīng)用于口蹄疫病毒的工業(yè)生產(chǎn)，生產(chǎn)規(guī)模達(dá)4000 L以上，顯著提升了口蹄疫抗原的品質(zhì)[9-10]。

研究表明，新城疫病毒在BHK貼壁細(xì)胞中能夠穩(wěn)定增殖[11]，建立成熟的可放大的新城疫懸浮培養(yǎng)工藝將能夠極大促進(jìn)獸用疫苗的轉(zhuǎn)型升級(jí)。本研究通過對(duì)BHK-21細(xì)胞進(jìn)行低血清和無血清兩個(gè)階段的懸浮馴化，篩選出能穩(wěn)定傳代的BHK-21懸浮細(xì)胞系，由于貼壁至懸浮馴化過程中BHK-21細(xì)胞的生長(zhǎng)特性會(huì)發(fā)生改變，因此，傳代穩(wěn)定和能夠放大生產(chǎn)是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的必要條件，本研究懸浮馴化的BHK-21-sc細(xì)胞能夠穩(wěn)定傳代并實(shí)現(xiàn)在反應(yīng)器上生長(zhǎng)，證實(shí)該細(xì)胞能夠作為新城疫懸浮培養(yǎng)工業(yè)生產(chǎn)用細(xì)胞。

科學(xué)穩(wěn)定的病毒培養(yǎng)工藝參數(shù)是獲得均一、高品質(zhì)和高免疫原性的抗原必要條件。本研究通過逐一優(yōu)化病毒接毒量、TPCK胰酶添加量、病毒培養(yǎng)溫度及病毒收獲時(shí)間4個(gè)關(guān)鍵懸浮培養(yǎng)工藝參數(shù)，最終確定最佳病毒培養(yǎng)溫度為33 ℃、最佳接毒量為MOI=0.005、最佳TPCK胰酶添加量為終濃度5 μg/mL及最佳收獲時(shí)間為72 h，建立了雞新城疫病毒La Sota株的懸浮培養(yǎng)工藝。應(yīng)用該工藝進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，病毒增殖效率最高，CPE達(dá)90%以上，收獲的病毒液HA效價(jià)可達(dá)9log2，病毒含量不低于106.0TCID50/0.1mL。連續(xù)3批重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果顯示該懸浮培養(yǎng)工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠。為適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)，本試驗(yàn)還進(jìn)行了懸浮工藝放大研究，在16 L和50 L生物反應(yīng)器中逐級(jí)放大連續(xù)培養(yǎng)的3批BHK-21-sc懸浮細(xì)胞，病毒增殖曲線與5 L培養(yǎng)的細(xì)胞增殖曲線相近，用優(yōu)化后的新城疫病毒培養(yǎng)工藝在接毒后72 h達(dá)到病毒效價(jià)高峰，收獲的病毒液HA效價(jià)可達(dá)9log2，病毒含量均不低于106.0TCID50/0.1mL，證實(shí)了該懸浮培養(yǎng)工藝的穩(wěn)定性和可放大性，具有廣泛的發(fā)展前景，為最終全面提高新城疫疫苗質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過懸浮培養(yǎng)馴化和篩選獲得了形態(tài)良好、穩(wěn)定傳代的BHK-21-sc懸浮細(xì)胞株；該細(xì)胞以初始密度0.5×106cells/mL接種，培養(yǎng)72 h可增殖到6×106cells/mL左右，細(xì)胞活率達(dá)95%以上。同時(shí)獲得了雞新城疫病毒La Sota株的全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝：病毒接種劑量為MOI 0.005，TPCK胰酶添加終濃度為5 μg/mL，最佳培養(yǎng)溫度33 ℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h。應(yīng)用該細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝在5、16、50 L反應(yīng)器上懸浮培養(yǎng)BHK-21-sc懸浮細(xì)胞株生產(chǎn)雞新城疫病毒HA滴度不低于9log2，病毒含量不低于106.0TCID50/0.1mL。表明BHK-21-sc細(xì)胞無血清全懸浮生產(chǎn)雞新城疫病毒工藝穩(wěn)定，可以實(shí)現(xiàn)逐級(jí)放大和規(guī)?；a(chǎn)。