范冬茹，郭興，高智濤

(伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江 伊春 153000)

羊肚菌(MorchelladentaL.)又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，按Ain-sworth分類系統(tǒng)隸屬于子囊菌亞門(Aseomycotina)、盤菌綱(Diseomyeetes)、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)[1]。具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，是一種大型的食用兼藥用真菌。它不僅營養(yǎng)豐富、味道鮮美，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌含抑制腫瘤的多糖，具有增強機體免疫力、抗疲勞、抗病毒、抑制腫瘤等作用[2]。我國從20世紀(jì)80年代開始，多家單位進行了羊肚菌的人工栽培研究，也有報道室外人工栽培成功，但均不能穩(wěn)產(chǎn)甚至很難重復(fù)。直到2000年，外營養(yǎng)添加技術(shù)(營養(yǎng)袋)的發(fā)明對室外羊肚菌人工栽培產(chǎn)生了積極的推動作用，現(xiàn)在全國大部分省份都有栽培，栽培的主要種類為梯棱羊肚菌(MorchellaimportunaM.Kuo et al.)、六妹羊肚菌(MorchellasextelataM.Kuo)及少量七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata)[3]。

伊春市位于中國黑龍江省東北部小興安嶺腹地的湯旺河流域，屬寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候。筆者通過引種栽培實驗，篩選出了適宜伊春地區(qū)生長的羊肚菌菌種，本文對該菌種的菌絲生長所需的碳源、氮源、酸堿度3個因素進行單因素試驗，以期為伊春地區(qū)發(fā)展羊肚菌產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 供試菌株

供試菌種為經(jīng)栽培試驗后篩選出的適宜在伊春地區(qū)生長的羊肚菌品種，該品種引自河南鄭州，為六妹羊肚菌(Morchellaseptimelata)。

1.2 培養(yǎng)基

菌種分離及保存培養(yǎng)基：

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然。

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，pH自然，水1000 mL。

1.3 試劑

國產(chǎn)分析純試劑：葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母浸膏、尿素、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、濃鹽酸、氫氧化鈉；國產(chǎn)食品級試劑：黃豆粉。

1.4 儀器與設(shè)備

AL-104高精度電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DZB-718便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺 蘇州廣源凈化科技有限公司；HZ-2111KB立式震蕩培養(yǎng)箱 金壇市盛藍儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 菌種活化與接種

將原始菌種接種到PDA 斜面培養(yǎng)基中，放入20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，對其進行傳代活化。

150 mL培養(yǎng)液裝于250 mL三角瓶中，滅菌。無菌條件下，在活化的菌種上挑取大小一致的10個接種點分別接入到制備好的各種培養(yǎng)基中，搖床設(shè)置轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度20 ℃，培養(yǎng)7天。

2.2 菌絲生長速度測量

選取活化后菌絲生長旺盛、菌絲生長速度一致的菌種，挑取2 mm×2 mm左右的接種點接種于PDA斜面上，10個重復(fù)，放置于恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度20 ℃。每天觀察菌絲密度、顏色變化并測量菌絲生長長度，至菌絲長滿試管為止。并根據(jù)測得的菌絲生長長度和培養(yǎng)的天數(shù)計算出每日生長速率。

2.3 碳氮源對菌絲體生物量的影響

以液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖和蛋白胨含量為標(biāo)準(zhǔn)，用相同質(zhì)量的乳糖、蔗糖、可溶性淀粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，用相同質(zhì)量黃豆粉、酵母粉、尿素代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，150 mL培養(yǎng)液裝于250 mL三角瓶中，3個重復(fù)，滅菌，接種，培養(yǎng)。將培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液倒入抽濾瓶中，進行抽濾，抽濾過程中流動地加入些許蒸餾水對菌絲體進行沖洗，抽濾后得到較干的菌絲體，再放置于烘箱中，溫度設(shè)置為70 ℃，待完全烘干后，稱量菌絲體生物量[4]。

2.4 pH對菌絲體生物量的影響

用NaOH 和HCl將液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值調(diào)為4個梯度，分別為6、6.5、7、7.5，滅菌后接種。每個梯度重復(fù)3次，培養(yǎng)方法及菌絲體生物量測量同2.3。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌絲生長速率分析

由圖1可知，菌絲每日生長速率呈明顯上升趨勢。接菌1天后，菌種全部萌發(fā)，菌絲潔白纖細(xì)稀疏，平均生長長度為4.58 mm左右；接種2天時，菌絲較密；接種4天時，全部滿管，菌絲濃密,菌絲生長速率達到20.81 mm；接種5天時，氣生菌絲較多，且爬上斜面上部玻璃；接種6天時，表面出現(xiàn)白點狀菌核。

圖1 每日菌絲生長速率

3.2 碳源和氮源對菌絲體生物量的影響

由表1所示，該菌種在4種碳源中均可生長，菌絲生物量和菌絲生長狀態(tài)存在明顯差異。以4種碳源為培養(yǎng)基的菌絲生物量從大到小依次為葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉，且葡萄糖與其它3種碳源在0.05水平上存在顯著性差異；在以葡萄糖、蔗糖為碳源的培養(yǎng)基顏色呈淺黃色，在以乳糖、可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基顏色呈褐色。綜合菌絲長勢，此種羊肚菌的最適碳源為葡萄糖。

表1 碳源對菌絲生長的影響

3.3 氮源對菌絲體生物量的影響

由表2所示，4種氮源均可提供該菌種生長所需的氮源，且菌絲生物量從大到小依次為酵母浸膏、豆末、蛋白胨、尿素，這4種氮源在0.05水平上存在顯著性差異；在以酵母浸膏、豆末為氮源的培養(yǎng)基顏色呈褐色，在以蛋白胨、尿素為氮源的培養(yǎng)基顏色呈淺黃色。綜合菌絲長勢，最適氮源為酵母浸膏。

表2 氮源對菌絲生長的影響

3.4 pH對菌絲體生物量的影響

該菌種在培養(yǎng)基pH值為6.0、6.5、7.0、7.5四個梯度中的生長情況見表3，隨著pH值由小到大，菌絲生物量不斷增加、菌絲長勢由弱變強、培養(yǎng)基顏色由淺變深。表明該菌種適宜在偏堿性的培養(yǎng)基中生長，四個梯度中7.5為最適pH值。

表3 pH對菌絲生長的影響

4 結(jié)論

通過液體培養(yǎng)對適宜伊春地區(qū)生長的羊肚菌菌種進行單因素試驗，研究影響其菌絲生長的因素。不同碳源對菌絲生長有明顯的影響，菌絲在葡萄糖培養(yǎng)基中長勢最佳、菌絲生物量最大，其次是蔗糖培養(yǎng)基，再次為乳糖培養(yǎng)基，在可溶性淀粉中最差，且葡萄糖與其它各組對菌絲生長影響在0.05水平上差異顯著。不同氮源處理對菌絲生長有明顯的影響，菌絲在酵母浸膏中長勢最好、生長速率最快，其次是豆末、蛋白胨培養(yǎng)基，尿素培養(yǎng)基最差，不適宜做該羊肚菌的氮源。在不同pH下，菌絲在偏堿性的環(huán)境下，長勢良好，6.0、6.5、7.0、7.5四個梯度中，7.5為最適pH值。pH值大于7.5時，是否能使菌絲生物量增加，有待于進一步試驗。試驗結(jié)果表明：該羊肚菌菌絲生長最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母浸膏，最適pH值為7.5。