關健飛,曹 陽

牡丹江師范學院歷史與文化學院, 牡丹江 157000

受全球氣候變化影響,中國平均氣溫變化趨勢與全球變化趨勢一致,而東北地區(qū)氣溫升溫幅度高于全國的平均升溫幅度[1],是增溫最快的地區(qū)之一[2]。東北多年凍土區(qū)是歐亞大陸多年凍土區(qū)的南緣地帶,凍土賦存條件脆弱,熱穩(wěn)定性差,易受氣候和外界環(huán)境變化的影響,生態(tài)系統(tǒng)敏感性強[3]。位于東部季風區(qū)北部的黑龍江省緯度位置偏北,受強大的西伯利亞、蒙古高壓影響形成嚴寒的大陸性氣候,形成和發(fā)育創(chuàng)造了不同類型的凍土和凍土特征。黑龍江省多年凍土分布于47°30′—53°33′N,分為三個亞區(qū),分別為大興安嶺北部大片多年凍土亞區(qū)、大興安嶺中部大片島狀多年凍土亞區(qū)以及大、小興安嶺島狀-稀疏島狀多年凍土亞區(qū)；其余地區(qū)為季節(jié)性凍土區(qū)[4]。

凍土,一般是指溫度在0℃或0℃以下,并含有冰的各種巖土和土壤。凍土作為一種溫度敏感和易變的地質體,是氣候變化的敏感區(qū),氣候變化是影響凍土的重要因素,微生物對于預測凍土和氣候之間的潛在反饋機制至關重要[5-6]。微生物作為凍土生態(tài)系統(tǒng)中的重要角色扮演者,是其內部多種功能聯(lián)通的生態(tài)群體[7]。凍土微生物在凍土生物地球化學循環(huán)中(如土壤碳氮循環(huán)、溫室氣體排放等)具有重要的作用[8- 10],且在一定程度上能夠指示全球氣候變化。在全球氣候變暖的背景下,研究凍土微生物群落特征及其與環(huán)境因子變化的關系逐漸成為當前熱點研究領域[11]。微生物的種群結構和遺傳進化對環(huán)境條件變化敏感,研究不同凍土區(qū)土壤中微生物的多樣性和種群結構將有助于及時檢測環(huán)境變化并采取有效的應對措施[12]。環(huán)境因子被認為是影響微生物群落發(fā)生變化的主要驅動力[13],如土壤pH[14]、氣候條件[15]、有機質含量[16]等都可以在一定程度上影響微生物群落的組成和分布。

土壤微生物數(shù)量巨大、結構復雜,傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)計數(shù)僅僅能夠分離培養(yǎng)1%的微生物,很難全面、準確的解析土壤微生物的結構組成和多樣性變化規(guī)律[17-19]。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展,高通量測試分析技術作為微生物群落的有效研究手段,被廣泛的應用在土壤微生物研究領域,其中包括物種的多樣性、豐富度、種內/種間相互作用、對環(huán)境變化響應等方面的研究[20-21]。本研究以黑龍江省表層凍土樣品為研究對象,通過高通量分子測序手段,分析黑龍江省表層凍土細菌群落組成和分子生態(tài)網絡特征,預測群落功能,探究環(huán)境因素、利用方式對于黑龍江表層凍土微生物群落空間異質性的影響。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

黑龍江省,介于北緯43°26′—53°33′,東經121°11′—135°05′,是氣候變化導致氣溫升高幅度最明顯的地區(qū)之一。全省年平均氣溫多在- 5℃—5℃之間,由南向北降低,大致以嫩江、伊春一線為0℃等值線。無霜凍期全省平均介于100—150 d之間,終霜凍在4月下旬至5月上旬結束。年降水量全省多介于400—650 mm之間,中部山區(qū)多,東部次之,西、北部少。其北部的多年凍土屬歐亞大陸多年凍土區(qū)的南緣地帶,凍土類型主要為多年凍土和季節(jié)性凍土。

1.2 采樣點布設及樣品采集

本研究以黑龍江省表層(0—20 cm)凍土為研究對象,全省區(qū)域內共設置采樣點19個(如圖1所示),于2019年5月1—4日期間完成土壤樣品采集。各采樣點處設置10 m×10 m樣地,四角及對角線交點處分別進行表層土壤樣品的采集,去除雜物、細跟等雜物后充分混勻,置于密封袋中,帶回實驗室后,一部分- 80℃保存用于高通量測試分析,一部分常溫風干用于土壤理化性質測定。

圖1 采樣點分布

1.3 研究方法

1.3.1土壤微生物群落測定

采用E.Z.N.A.? soil DNA Kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取土壤總DNA,應用NanoDrop2000進行DNA純度和濃度檢測,DNA完整性檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法(1%瓊脂糖膠,5V/cm,20min)。采用16S rRNA基因的V3-V4區(qū)引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG- 3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT- 3′)對高變區(qū)片段進行擴增。PCR反應條件為95℃預變性3min；27次循環(huán)(95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s)；72℃延伸10 min,至10℃。20 μL反應體系為4 μL的5×FastPfu Buffer,2 μL的2.5 mM dNTPs,0.8 μL的Forward Primer(5 μM),0.8 μL的Reverse Primer(5 μM),0.4 μL的FastPfu Polymerase,0.2 μL的BSA,10 ng的Template DNA,補ddH2O至20 μL。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建文庫,利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序,委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.2土壤理化性質測定

土壤含水率的測定采用真空烘箱法(NY 525- 2012/5.6)；pH的測定采用電位法(NY/T 1377- 2007)；有機質的測定采用重鉻酸鉀滴定法(NY/T 1121.6- 2006)；全氮的測定采用半微量開氏法(NY/T 53- 1987)；全磷的測定采用氫氧化鈉堿融-鉬銻抗比色法(NY/T 88- 1988)；全鉀的測定則采用火焰光度法(NY/T 87- 1988)；硝態(tài)氮采用連續(xù)流動分析儀法進行測定(LY/T 1228- 2015)；有效磷采用鉬銻抗比色法(NY/T 1121.7- 2014),其中酸性土壤使用氟化銨-鹽酸作為浸提劑,堿性土壤使用碳酸氫鈉作為浸提劑；速效鉀則使用乙酸銨浸提,火焰光度計測定(NY/T 889- 2004/3.10)。每個土壤樣品測三次取平均值記錄,結果如表1所示。

表1 各采樣點土壤理化性質均值(n=3)

1.4 數(shù)據分析

采用Illumina MiSeq平臺對測序樣本進行雙端測序。高通量測試結果分析過程主要是參照Qiime2文檔中名為"Atacama soil microbiome tutorial"的教程來完成(https://docs.qiime2.org/2019.1/)。原始序列通過質控、去噪、拼接及去嵌合體,形成OTU。選取代表性OTU序列,與核糖體RNA數(shù)據庫(Greengenes Database 13_8版本[按99%序列相似性聚類])進行比對獲得物種注釋信息。

Alpha多樣性以及Beta多樣性的分析主要用qiime2 diversity插件完成。Alpha多樣性指數(shù)用于評估樣本本身的多樣性程度,Beta多樣性指數(shù)用于評估樣本之間的微生物群落結構差異性[22]。使用了冗余分析方法(RDA)揭示微生物群落與相關環(huán)境因子之間的潛在關聯(lián)?；跇颖局兄饕⑸镂锓N相對豐度,使用共現(xiàn)網絡分析(Co-occurrence analysis)計算斯皮爾曼等級相關系數(shù)用于了解物種之間的關聯(lián)。應用PICRUSt軟件預測微生物群體可能的功能組成[23]。

2 結果與討論

2.1 細菌群落結構分析

2.1.1測試數(shù)據分析

黑龍江表層凍土19個采樣土壤中共得到原始序列785640條,隨機抽取有效序列,構建Alpha多樣性稀釋曲線(Rarefaction Curve)(圖2),各樣本曲線趨于平緩,繼續(xù)增加測序深度已無法再檢測到大量新的OTU,表明測序結果足夠反映各土壤樣本中細菌的多樣性?；诜淳嚯x權重插值方法,對門分類水平上每個樣品的序列數(shù)目占總序列數(shù)的比例進行插值分析發(fā)現(xiàn),黑龍江省表層凍土細菌序列數(shù)目占總序列數(shù)的比例自西向東呈現(xiàn)下降趨勢。

圖2 各樣本Alpha多樣性稀釋曲線

2.1.2細菌群落組成分析

黑龍江省表層凍土檢測到的細菌OTUs可劃分為30個門,109個綱。209個目,326個科,512個屬,598個種,其中優(yōu)勢菌門主要包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)。Proteobacteria相對豐度在49.81%至22.01%之間,采樣點1處相對豐度最高。Actinobacteria相對豐度在45.33%—11.02%之間,采樣點1處相對豐度最低。Acidobacteria相對豐度在17.83%—5.54%之間,Chloroflexi相對豐度在11.44%—0.73%之間,該四類菌門相對豐度之和均占各樣本中細菌相對豐度的70%以上(圖3),該四類優(yōu)勢細菌門,在P<0.01水平上,Proteobacteria與Actinobacteria、Chloroflexi極顯著負相關,與Acidobacteria極顯著正相關,相關系數(shù)分別為-0.748、-0.573、0.281。Actinobacteria與Acidobacteria極顯著負相關,與Chloroflexi極顯著正相關,相關系數(shù)分別為-0.633和0.052。Acidobacteria和Chloroflexi之間則無顯著相關性。

圖3 各個樣本在門水平的物種相對分布

主要屬水平上細菌物種相互作用網絡如圖4所示,圓圈代表一個物種,大小代表其相對豐度,不同的顏色代表不同的物種門分類,圓圈之間的線條代表這兩個物種間的相關性顯著(校正錯誤發(fā)現(xiàn)率的秩相關的P值小于0.05),線條顏色紅色代表正相關,藍色代表負相關,線條越粗,相關系數(shù)絕對值越大。大部分菌屬之間的相關性均為顯著正相關,只有Flavobacteriu屬和Burkholderia屬,Microlunatus屬和Massilia屬之間呈現(xiàn)顯著負相關。對樣品間具有顯著性差異的屬水平上物種進行ANCOM(Analysis of composition of microbiomes)分析,該方法專門用于比較物種在組間的顯著性差異,其中W值越高,代表該物種在組間的差異顯著性越高,clr值越高代表相對豐度差異越大。Aetherobacter在各樣本之間差異最大(W=83,clr=16.58),其次為Planctmyces(W=16,clr=4.39)和Constrictibacter(W=2,clr=8.46)(圖5)。

圖4 主要屬水平上細菌物種相互作用網絡圖

圖5 物種屬水平分類的ANCOM豐度比較結果

2.1.3細菌群落多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)用于樣品中物種多樣性的分析,chao1指數(shù)是用來反映物種豐富度的指標,Simpson和Shannon指數(shù)分析用于樣本的物種多樣性,除上面所說物種豐富度的涵義外,還指所有物種個體數(shù)目的分配的均勻程度。黑龍江省表層凍土細菌多樣性chao1指數(shù)在768.6至368.0之間,其中采樣點15處的指最大,其次為采樣點11和18處；而采樣點8處chao1多樣性指數(shù)最低,其次為采樣點9處。Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)在采樣點15處值均為最大,分別為0.997和9.13,而采樣點18處最小,分別為為0.986和8.18。表明采樣點15處細菌豐富度較高,物種分布均勻度較好,而采樣點18處雖然細菌豐富度較高,但均勻度較差。Beta多樣性指數(shù)是對不同樣品間的微生物群落構成進行比較分析,Bray Curtis距離是生態(tài)學上反應群落之間差異性最常用的指標,其值越小,表示這兩個樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。采樣點1與其他樣點之間Bray Curtis距離值均大于0.87,與采樣點12處差異性最大,為0.99；采樣點10和13處距離值為0.53,差異最小。

2.2 細菌群落功能預測

基于PICRUSt的原理對菌群代謝功能進行預測,結果如圖6所示。微生物群落功能在組間差異不明顯,每個樣品中的菌群主要呈現(xiàn)20種代謝功能,其中膜轉運功能基因、氨基酸代謝功能基因、碳水化合物代謝功能基因所占的相對比例較高,在每個樣品中這三種功能基因均達到10%以上。其次為復制和修復功能基因、能量代謝功能基因,相對比例在5%—7%之間。其他功能基因,如信號轉導、脂類代謝等相對比例均在5%以下。

圖6 微生物群落功能預測組成柱形圖

2.3 細菌群落與土壤理化性質相關性分析

為反映細菌與環(huán)境因子之間的關系,先進行DCA分析,最大軸的值小于4,進行RDA多元回歸分析,進而得到顯著影響細菌分布的環(huán)境驅動因子。門水平上(圖7,圖8),pH是影響細菌群落結構組成的最主要因子,與Crenarchaeota、Verrucomicrobia、Thermi呈極顯著正相關,與Elusimicrobia呈極顯著負相關,與Actinobacteria、Cyanobacteria呈顯著正相關,與Proteobacteria、AD3呈顯著負相關。其次分別為OM、C/N、WC。在P<0.001水平上,OM與Actinobacteria呈現(xiàn)負相關性,與Elusimicrobia呈正相關性。屬水平上,pH同樣是最為主要的影響因子,其次為WC、TP、OM、C/N,與這些主要環(huán)境因子具有顯著相關性的菌屬如圖9和圖10所示。追蹤細菌種屬關系分析發(fā)現(xiàn),pH與Actinobacteria門的Arthrobacter屬、Cyanobacteria門的Blastococcus屬、Proteobacteria門的Chelatococcus在P<0.001水平上顯著正相關相關。Kribbella屬(Proteobacteria門)和Granulicella屬(Actinobacteria門)則在0.001≤P<0.01水平上與pH分別呈現(xiàn)顯著正相關和負相關。Microlunatus屬(Actinobacteria門)和Microlunatus屬(Proteobacteria門)則下0.01≤P<0.05水平上與pH分別呈現(xiàn)顯著負相關和正相關。

圖9 RDA排序圖(屬水平)

圖8 門水平細菌與理化性質相關性熱圖

圖7 RDA排序圖(門水平)

2.4 利用方式對細菌群落分異影響分析

黑龍江省區(qū)域內共設置的19個采樣點分屬于五種利用類型土壤,Group1為森林-林地土壤(n=5),Group2為菜園-果園土壤(n=5),Group3為農田土壤(n=5),Group4為城區(qū)綠地土壤(n=5),Group5為居民區(qū)土壤(n=4),Alpha多樣性以及Beta多樣性在各組之間均無顯著差異。選取細菌物種絕對豐度前20的菌門進行聚類分析,研究不同樣品間的相似性,結果如圖11所示,19個采樣點被聚為6類,每類中均包括不同利用方式的土壤樣品,表明利用方式不是影響黑龍江省表層凍土細菌群落結構的主要因素。

圖11 不同利用類型土壤種細菌門水平的分類熱圖

3 討論

土壤中的細菌群落通常由相似的優(yōu)勢菌門組成,包括Acidobacteria,Actinobacteria,Proteobacteria,Bacteroidetes,Verrucomicrobia和Chloroflexi等[24-25],這些菌門在凍土中也常作為優(yōu)勢菌門被檢出[8]。王艷發(fā)等[26]對青藏高原凍土細菌群落結構研究發(fā)現(xiàn),Proteobacteria、Actinobacteria作為優(yōu)勢菌門在凍土層中被檢出。有研究表明,Actinobacteria更加適應低溫環(huán)境[27],Proteobacteria在凍土在活動層具有一個很高的比例[28]。程亮等[29]研究發(fā)現(xiàn),除了Actinobacteria、Proteobacteria之外,Acidobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi同樣在青藏高原凍土中具有較高的豐富度。韓睿等[30]對青海果洛地區(qū)凍土中微生物進行測試分析發(fā)現(xiàn)Bacteroidetes和Proteobacteria為優(yōu)勢菌門。本研究中,黑龍江表層凍土優(yōu)勢菌門同樣為以上菌門,且優(yōu)勢程度明顯。屬水平上,Aetherobacter是革蘭氏陰性變形菌,廣泛存在于土壤環(huán)境介質中,其富產二級代謝物,被成為自然界天然產物制造工廠,本研究中發(fā)現(xiàn)的Actinobacteria門的Arthrobacter屬在許多凍土中被查出,如北極、南極、青藏高原、天山等,并且可作為優(yōu)勢菌群進行培養(yǎng)[11]。Planctmyces類群普遍存在于凍土環(huán)境中,且該類群經長期低溫誘導,已形成較為適應該類環(huán)境的生理特性。凍土中Flavobacteriu屬和Burkholderia屬,Microlunatus屬和Massilia屬之間呈現(xiàn)顯著負相關性則未見相關報道。

研究表明,在不同空間尺度和生態(tài)系統(tǒng)的凍土中,pH對細菌群落結構組成存在顯著影響[14,31]。一方面是由于土壤中的細菌最適生長pH值范圍較窄[32-33]；另一方面是由于pH通過調節(jié)土壤養(yǎng)分的可利用性進而影響細菌群落結構[34]。本研究中,黑龍江表層凍土pH在5至9之間,對細菌群落結構組成影響顯著,與其他人研究結果一致[35]。已有研究表明有機質含量顯著影響凍土微生物群落結構[36]。碳氮是凍土中微生物的主要營養(yǎng)物質,微生物作為凍土碳氮循環(huán)的重要參與者,土壤碳氮含量直接對其群落的活性與分解作用產生影響[37-38],本研究中土壤C/N作為環(huán)境因素對于凍土微生物群落結構影響顯著。凍土微生物數(shù)量與土壤水分含量呈現(xiàn)顯著正相關[39],而本研究中土壤水分含量對凍土微生物群落結構的影響同樣呈現(xiàn)顯著正相關關系。李昌明[40]對青藏高原多年凍土區(qū)土壤微生物及其與環(huán)境關系的研究發(fā)現(xiàn),凍土土壤理化因子中的土壤水分與養(yǎng)分一起控制著微生物群落豐度和組成,而凍土土壤pH值和C/N更多的調控著細菌群落的多樣性,與本研究結果一致。

在對全球表層土壤微生物群落結構和功能進行研究分析發(fā)現(xiàn),環(huán)境變化與細菌門水平組成上表現(xiàn)出強相關性,環(huán)境變量對土壤表層細菌結構及功能的影響更大[41]。土壤中細菌群落之間的相似性更多地受到土壤性質的控制(特別是土壤pH)。土壤利用[42]、管理[43]、種植模式[44]對細菌群落結構的影響也是顯著的。而在本研究中,黑龍江省區(qū)域尺度范圍內,表層凍土中細菌群落結構分異主要受土壤理化性質影響,而土壤利用方式對微生物群落結構影響不顯著。

4 結論

黑龍江省表層凍土優(yōu)勢菌門主要包括Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes、Verrucomicrobia。Aetherobacter屬在各樣本之間顯著性差異最大,Flavobacteriu屬和Burkholderia屬,Microlunatus屬和Massilia屬之間呈現(xiàn)顯著負相關。pH是影響細菌群落結構組成的最主要環(huán)境因子?；诩毦蚪M的16S rRNA序列對菌群代謝功能進行預測發(fā)現(xiàn),細菌群落主要代謝功能表現(xiàn)在膜轉運功能、氨基酸代謝功能以及碳水化合物代謝功能三方面。凍土表層土壤理化性質的差異性決定了黑龍江省區(qū)域尺度范圍內土壤細菌群落結構的分異,而本研究中涉及的土壤利用方式對微生物群落結構影響不顯著。