仲志婷 苗青青 蔣柱燕 張夢(mèng)潔 唐雋

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901 醫(yī)院皮膚科，合肥230031；2陸軍軍醫(yī)大學(xué)病理生理與高原病理學(xué)教研室，重慶400038

環(huán)狀RNA（circRNA）是一種非編碼RNA分子，沒(méi)有5′端帽和3′端poly（A）尾部，通過(guò)共價(jià)鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)［1］。circRNA 可作為miRNA 的“海綿”來(lái)調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)［2］，調(diào)節(jié)親本基因轉(zhuǎn)錄［3］，與RNA 結(jié)合蛋白相互作用［4］，以及翻譯蛋白質(zhì)［5］。我們前期研究［6］采用高通量RNA測(cè)序，分析了3例系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者與3例健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中circRNA 的差異表達(dá)，通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出4 個(gè)候選circRNA，并經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）證實(shí)circ蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型（PTPN22）在SLE患者PBMC中表達(dá)降低，且與SLE 疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。本研究探討circ-PTPN22的翻譯能力及其翻譯蛋白對(duì)Jurkat細(xì)胞活化和凋亡的作用。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

2019 年5 月10 日至9 月30 日分別于西南醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕免疫科和體檢中心收集6 例SLE女性患者（SLEDAI評(píng)分10 ～14分）和9例健康女性對(duì)照全血樣本，年齡25 ～50 歲。本研究經(jīng)解放軍第105 醫(yī)院（現(xiàn)更名為解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（ 倫理編號(hào)105LL20150308），所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

二、細(xì)胞來(lái)源及主要試劑

Jurkat 細(xì)胞系來(lái)源于美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)。RiboTM熒光原位雜交試劑盒（廣州銳博生物技術(shù)有限公司），circ-PTPN22-cy3探針和18S-cy3對(duì)照探針均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單抗（美國(guó)Bioss公司），山羊抗兔抗體、山羊抗小鼠抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），circ-PTPN22-FLAG 和circ-PTPN22-NC-FLAG 重組慢病毒由上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司構(gòu)建，circ-PTPN22-shRNAFLAG和circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG慢病毒由上海泰兒圖生物科技有限公司合成。Dynabeads?Human T-Activator CD3/CD28 用于活化和擴(kuò)增人T細(xì)胞（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。藻紅蛋白標(biāo)記的抗人白細(xì)胞介素（IL）-2 抗體、7-AAD Viability Staining Solution（美國(guó)Biolegend 公司），小鼠抗FLAG?M2 單抗（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司），ELISA 試劑盒（英國(guó)abcam 公司），RIPA 裂解液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、Quick-Blocker 封閉液、2×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），ExpressPlus?PAGE Gels 4%～20%（南京金斯瑞生物科技有限公司），EasySep?人T細(xì)胞分離試劑盒、EasySep?人B 細(xì)胞分離試劑盒、EasySep?人NK 細(xì)胞分離試劑盒（加拿大STEMCELL Technologies 公司），eBioscience?Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子染色液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

三、方法

1.PBMC分離：全血與磷酸鹽緩沖液（PBS）及樣本密度分離液體積比為1∶1∶1，805×g離心20 min，取白膜層，加PBS 10 ml，201×g 離心5 min 后棄上清液，得到PBMC。加入二甲基亞砜和胎牛血清（體積比1∶9），-80 ℃過(guò)夜，第2天轉(zhuǎn)入液氮中保存。

2.熒光原位雜交法觀察circ-PTPN22在健康人PBMC中的表達(dá)定位：針對(duì)circ-PTPN22剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)一段帶有cy3 標(biāo)記的探針circ-PTPN22-cy3，對(duì)照組探針為18S-cy3。從3 例健康人5 ml 全血樣本中分離PBMC。50 μl PBS 重懸PBMC，取2 張多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片，分別標(biāo)記為circ-PTPN22-cy3組和18S-cy3組。各取10 μl細(xì)胞懸液到載玻片，靜置待干。然后依次用4%多聚甲醛室溫固定10 min，預(yù)冷通透液4 ℃5 min，200 μl預(yù)雜交液37 ℃30 min，避光下將circ-PTPN22-cy3 和18S-cy3 兩種探針各1.5 μl 分別加入100 μl 預(yù)熱的雜交液混勻，棄去載玻片上的預(yù)雜交液，將探針混合物滴到含有細(xì)胞的載玻片上，放入濕盒，37 ℃避光過(guò)夜。第2天，42 ℃避光條件下，分別用雜交洗液Ⅰ、雜交洗液Ⅱ、雜交洗液Ⅲ洗滌，然后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色10 min，最后熒光顯微鏡下拍照。

3. Jurkat 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒轉(zhuǎn)染：用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素）、在37 ℃5% CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)Jurkat 細(xì)胞，第2 天換液。為驗(yàn)證預(yù)測(cè)的circ-PTPN22 蛋白編碼功能，分別將circ-PTPN22-FLAG、circ-PTPN22-NCFLAG、circ-PTPN22-FLAG + circ-PTPN22-shRNAFLAG、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG 重組慢病毒［病毒載體含綠色熒光蛋白（GFP）基因］轉(zhuǎn)入Jurkat細(xì)胞（circ-PTPN22-FLAG 組、circ-PTPN22-NCFLAG 組、circ-PTPN22-shRNA-FLAG 組、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG 組），同時(shí)設(shè)置Jurkat 細(xì)胞對(duì)照組（僅正常培養(yǎng)）。采用12 孔板，每孔5 ×105個(gè)細(xì)胞，每組各3 個(gè)復(fù)孔，重組慢病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）均為50。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，期間可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)添加完全培養(yǎng)基和傳代。

4.circ-PTPN22pro 抗體制備與鑒定：委托上海烈冰生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)定circ-PTPN22核酸序列。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，委托杭州華安生物技術(shù)有限公司［動(dòng)物試驗(yàn)許可證號(hào)：SYXK（浙）2017-0009］針對(duì)circ-PTPN22 剪接位點(diǎn)處的特異性氨基酸序列GNSNYLPVSLQELARP 合成肽段并制備多克隆抗體，然后使用親和層析柱純化抗體。采用常規(guī)多克隆抗體制備方法，選用2 只體重2.5 kg 左右的健康新西蘭雄性白兔（編號(hào)為4137、4138），采用多點(diǎn)皮下注射各免疫3次，首次免疫后第14天進(jìn)行2次免疫，第2 與第3 次免疫間隔7 d，第3 次免疫后第7 天，于兔耳中動(dòng)脈采少量全血提取血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。檢測(cè)合格后，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，7 d后可采集全血。采用轉(zhuǎn)染了circ-PTPN22 的Jurkat 細(xì)胞鑒定所制備的多克隆抗體，將轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞裂解上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用所制備兔抗血清作為一抗進(jìn)行Western印跡法分析。

5. 間接ELISA 法檢測(cè)制備的兔抗circ-PTPN22pro 抗體效價(jià)：按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)依次進(jìn)行包被抗原（合成的目的肽段）、1×TBST緩沖液洗滌、TBST配制的1%牛血清白蛋白（BSA）封閉，加入稀釋的待檢樣品（即制備的抗體）37 ℃反應(yīng)1 h、洗滌2 次。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照孔（陽(yáng)性血清）與陰性對(duì)照孔（BSA）。然后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗羊抗兔抗體孵育，1×TBST 緩沖液洗3次。加底物顯色，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)后，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。各實(shí)驗(yàn)孔與BSA陰性對(duì)照孔A450比值＞2.1時(shí)，為抗體滴度判定終點(diǎn)。

6.磁珠分選人PBMC：根據(jù)EasySep?Human T Cell Isolation Kit，分別用250 μl EasySep?緩沖液重懸3 例健康對(duì)照和3 例SLE 患者各15 ml 全血提取的PBMC，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每管加入50 μl/ml Isolation Cocktail，混勻后室溫等待5 min，振蕩30 s后每管加入40 μl/ml RapidSpheres?，用EasySep?緩沖液補(bǔ)齊至2.5 ml，混勻后放入配套的磁鐵中，室溫靜置3 min，垂直將細(xì)胞懸液倒入另一新流式管中，將新管放入磁鐵中，靜置3 min，同樣的方法倒出，得到分選后的T 細(xì)胞。參照上述方法分選B、NK細(xì)胞。用相應(yīng)的抗體檢測(cè)細(xì)胞純度。

7. Western 印跡法檢測(cè)細(xì)胞中circ-PTPN22pro蛋白表達(dá)：按照“3.Jurkat 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒轉(zhuǎn)染”中方法轉(zhuǎn)染48 h 后，收集各組Jurkat 細(xì)胞，RIPA 裂解液提取總蛋白。加入2 × SDS 蛋白上樣緩沖液（1∶1），煮沸變性。每孔上樣量30 μg，160 V恒壓電泳35 min，25 V 25 mA 6 min 半干轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，室溫封閉30 min，分別加一抗小鼠抗FLAG標(biāo)簽抗體（1∶1 000）、兔抗人GAPDH抗體（1∶4 000）4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜5 次，每次6 min；加二抗山羊抗兔、山羊抗鼠抗體（均為1∶4 000）室溫?fù)u晃孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，然后用Bio-Rad 成像儀曝光拍照。使用Image Lab 6.0 軟件計(jì)算每組circ-PTPN22pro 條帶與GAPDH 條帶的調(diào)整灰度值之比。此外，采用上述方法檢測(cè)3例健康對(duì)照和3 例SLE 患者PBMC 及另3 例健康對(duì)照和3 例SLE 患者T、B、NK 細(xì)胞亞群中circ-PTPN22pro 表達(dá)，一抗為制備的兔抗人circ-PTPN22pro 抗體（1∶500），二抗為山羊抗兔抗體。

8. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)circ-PTPN22 對(duì)細(xì)胞活化和凋亡的影響：按照“3.Jurkat 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒轉(zhuǎn)染”中方法將circ -PTPN22、circ-PTPN22-NC、circ-PTPN22 - shRNA、circ - PTPN22 -shRNA-NC 慢病毒分別轉(zhuǎn)染Jurkat 細(xì)胞（circ-PTPN22 組、circ-PTPN22-NC 組、circ-PTPN22-shRNA 組、circ-PTPN22-shRNANC 組）24、48 和72 h 后，每孔加Dynabeads ?Human T-Activator CD3/CD28 4 μl，恒溫孵育6 h 后收集轉(zhuǎn)染的Jurkat 細(xì)胞。分別用200 μl PBS重懸，各組取1×106細(xì)胞，加入200 μl穿孔液室溫20 min，500 μl 通透緩沖液453 × g 離心8 min，洗滌2次。重懸后每管加入1 μl藻紅蛋白抗人IL-2抗體，室溫避光20 min后洗滌2次，用含2%胎牛血清的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-2陽(yáng)性細(xì)胞比例，以檢測(cè)細(xì)胞活化狀態(tài)。此外，收集各組轉(zhuǎn)染48、72、96 h后的Jurkat 細(xì)胞，檢測(cè)前10 min每管加7-AAD Viability Staining Solution 2 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，即7-AAD陽(yáng)性細(xì)胞比例。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS25.0 軟件，采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析分別分析過(guò)表達(dá)和干擾circ-PTPN22 不同時(shí)間對(duì)Jurkat 細(xì)胞活化及凋亡的影響。采用GraphPad Prism8 軟件，兩組計(jì)量資料的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、circ-PTPN22在健康人PBMC細(xì)胞中的定位

熒光原位雜交法顯示，circ-PTPN22 和陽(yáng)性對(duì)照18S 均主要表達(dá)在健康人PBMC 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，見(jiàn)圖1。

二、circ-PTPN22的翻譯能力預(yù)測(cè)

測(cè)序結(jié)果顯示，circ-PTPN22基因全長(zhǎng)1 429 bp，含9 個(gè)外顯子。為預(yù)測(cè)該基因是否具有翻譯蛋白的能力，通過(guò)circRNADb 網(wǎng)站（http：//reprod.njmu.edu.cn/circrnadb）進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)出circ-PTPN22 第718 ～838位堿基共121 bp的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）序列（圖2A 綠色序列）。因?yàn)闇y(cè)得的circ-PTPN22全長(zhǎng)為1 429 bp，所以排除1 399 ～1 507 bp的潛在IRES 序列。翻譯能力預(yù)測(cè)見(jiàn)圖2B，ORF 框從910 bp 跨剪接位點(diǎn)至50 bp 處，潛在翻譯的蛋白質(zhì)序列共189 個(gè)氨基酸，將其命名為circ-PTPN22pro；GNSNYLPVSLQELARP 序列為該編碼蛋白不同于全長(zhǎng)PTPN22 蛋白的特異氨基酸序列（圖2B）。

圖1 熒光原位雜交法檢測(cè)circ-PTPN22在健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的定位 圖像融合后可見(jiàn)circ-PTPN22與18S均主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中

圖2 circ-PTPN22蛋白編碼預(yù)測(cè) 2A：circ-PTPN22基因的預(yù)測(cè)編碼序列；綠色部分代表IRES序列，灰色部分代表ORF框，跨剪接位點(diǎn)翻譯，紅色標(biāo)記ATG、TGA分別為翻譯的起始密碼子和終止密碼子；2B：circ-PTPN22pro的預(yù)測(cè)氨基酸序列，序列的紅色部分是不同于全長(zhǎng)PTPN-22蛋白的獨(dú)特氨基酸序列

三、circ-PTPN22pro多克隆抗體制備及鑒定

ELISA 結(jié)果顯示，3 次免疫后，2 只兔血清效價(jià)均達(dá)到1∶256 000。Western 印跡法鑒定circ-PTPN22pro 多克隆抗體顯示，4 137 號(hào)兔血清的特異性較好，相對(duì)分子質(zhì)量為20 000左右的目的條帶顯示清晰，但未檢測(cè)到全長(zhǎng)型PTPN22pro（相對(duì)分子質(zhì)量98 000）（圖3），提示circ-PTPN22pro 多克隆抗體制備成功，特異性針對(duì)circ-PTPN22pro。因此，在后續(xù)臨床相關(guān)實(shí)驗(yàn)中使用4 137 號(hào)兔血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

四、circ-PTPN22編碼功能驗(yàn)證

轉(zhuǎn)染重組慢病毒后48 h，circ-PTPN22-FLAG組、circ-PTPN22-NC-FLAG組、circ-PTPN22-shRNAFLAG 組、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG 組細(xì)胞均有綠色熒光表達(dá)（圖4A），說(shuō)明重組慢病毒轉(zhuǎn)染成功。Western 印跡結(jié)果顯示，circ-PTPN22-FLAG 組circ-PTPN22pro 表達(dá)明顯高于circ-PTPN22-NCFLAG 組和細(xì)胞對(duì)照組，且相對(duì)分子質(zhì)量約為20 000；circ-PTPN22-NC-FLAG 組及細(xì)胞對(duì)照組有少量表達(dá)，提示Jurkat 細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)circ-PTPN22pro（圖4B）。與circ-PTPN22-FLAG組相比，circ-PTPN22-shRNA-FLAG 組circ-PTPN22pro 表 達(dá)明顯降低，見(jiàn)圖4C。

五、circ-PTPN22對(duì)細(xì)胞活化和凋亡的影響

轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，circ-PTPN22 組IL-2 表達(dá)（22.20% ± 8.92%，31.10% ±5.88%，53.20% ± 10.25%）均低于circ-PTPN22-NC組（30.90% ± 11.00%，51.23% ± 10.70%，69.67% ±9.00%）；circ-PTPN22-shRNA組IL-2表達(dá)（35.57%±8.79%，78.10%± 10.08%，88.63%± 3.89%）均高于circ-PTPN22-shRNA-NC 組（26.73% ± 4.92%，41.03% ± 10.45%，41.33% ± 4.96%），見(jiàn)圖5A、5B。兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，circ-PTPN22 組與circ-PTPN22-NC 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =284.881，P=0.003）；circ-PTPN22-shRNA 組與circ-PTPN22-shRNA-NC 組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=293.818，P=0.003）。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)circ-PTPN22 對(duì)Jurkat 細(xì)胞活化和凋亡的影響 轉(zhuǎn)染24、48 和72 h 后，circ-PTPN22 組IL-2 表達(dá)均明顯低于circ-PTPN22-NC組（5A），circ-PTPN22-shRNA組IL-2表達(dá)均明顯高于circ-PTPN22-shRNA-NC組（5B）；轉(zhuǎn)染48、72、96 h后，circ-PTPN22組細(xì)胞凋亡率均高于circ-PTPN22-NC組（5C），circ-PTPN22-shRNA組細(xì)胞凋亡率亦明顯高于circ-PTPN22-shRNA-NC組（5D）

轉(zhuǎn)染48、72、96 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，circ-PTPN22 組細(xì)胞凋亡率（7.08% ± 1.33%，19.17% ±3.29%，30.03% ± 9.24%）高于circ-PTPN22-NC 組（5.01% ± 1.52% ，5.63% ± 0.81% ，14.22% ±3.96%），且circ-PTPN22-shRNA 組細(xì)胞凋亡率（24.63% ± 10.58%，59.17% ± 15.64%，84.87% ±2.91%）亦明顯高于circ-PTPN22-shRNA-NC 組（6.59% ± 3.37% ，5.33% ± 1.65% ，15.42% ±7.31%），見(jiàn)圖5C、5D。兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，circ-PTPN22 組與circ-PTPN22-NC 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 81.287，P = 0.012）；circ-PTPN22-shRNA 組與circ-PTPN22-shRNA-NC 組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=111.813，P=0.009）。

六、circ-PTPN22pro 在 健 康 對(duì) 照 和SLE 患 者PBMC中的差異表達(dá)

Western 印跡結(jié)果顯示，SLE 組PBMC 中circ-PTPN22pro 表達(dá)低于健康對(duì)照組，幾乎不表達(dá)（圖6A）。進(jìn)一步用磁珠分選后結(jié)果顯示，SLE 組T、B細(xì)胞中circ-PTPN22pro 表達(dá)（0.398±0.147、0.072±0.027）均顯著低于健康對(duì)照組（1.090 ± 0.365、0.512 ± 0.157；t 值分別為3.047、4.806；P 值分別為0.038、0.009），SLE組與健康對(duì)照組NK細(xì)胞中circ-PTPN22pro 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.139 ± 0.147比0.088±0.032；t=0.582，P=0.592），見(jiàn)圖6B。

討 論

一些有IRES 序列及ORF 框的circRNA 具有編碼蛋白能力［7］。我們?cè)赾ircRNADb數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)circ-PTPN22序列，發(fā)現(xiàn)circ-PTPN22有跨剪接位點(diǎn)翻譯的ORF 框，并在Jurkat 細(xì)胞中檢測(cè)出circ -PTPN22pro表達(dá)。通過(guò)熒光原位雜交法，我們檢測(cè)出circ-PTPN22 主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，提示circ-PTPN22 可能主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。與circ-PTPN22-NC 組相比，過(guò)表達(dá)circ-PTPN22 可抑制Jurkat 細(xì)胞活化，促進(jìn)Jurkat 細(xì)胞凋亡；而干擾了circ-PTPN22 的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞活化，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。推測(cè)細(xì)胞凋亡的原因可能是干擾circ-PTPN22 表達(dá)后，circ-PTPN22pro 蛋白表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度活化誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡［8］。

圖6 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）及其T、B、NK 細(xì)胞亞群中circ-PTPN22 蛋白表達(dá) 6A：PBMC 中circ-PTPN22pro表達(dá) 3例SLE患者均明顯低于3例健康對(duì)照；6B：T、B細(xì)胞中circ-PTPN22pro表達(dá) SLE患者均明顯低于健康對(duì)照，但兩組NK細(xì)胞中circ-PTPN22pro表達(dá)無(wú)明顯差異

通過(guò)制備兔抗circ-PTPN22pro 特異性多克隆抗體，我們檢測(cè)了SLE患者和健康對(duì)照PBMC及其T、B、NK細(xì)胞亞群中circ-PTPN22pro的表達(dá)。結(jié)果顯示，SLE 患者組PBMC 中circ-PTPN22pro 表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組，甚至不表達(dá)；SLE 患者組T、B細(xì)胞亞群中circ-PTPN22pro 表達(dá)亦顯著低于健康對(duì)照組，而兩組NK 細(xì)胞中circ-PTPN22pro 表達(dá)無(wú)明顯差異。提示circ-PTPN22 和circ-PTPN22pro 蛋白可能對(duì)SLE的發(fā)生發(fā)展有一定作用，是影響SLE疾病的重要靶標(biāo)分子之一。

PTPN22是一種淋巴特異性磷酸酶（Lyp），可抑制T細(xì)胞活化；當(dāng)PTPN22第620位精氨酸（R）突變成色氨酸（W）時(shí)，PTPN22活性增強(qiáng)，可抑制T 細(xì)胞受體（TCR）的信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)自身免疫的發(fā)展［9］。PTPN22突變體PTPN22-R620W（LypW）在多種自身免疫疾病中起重要作用，比如SLE［10］、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［11］等。SLE患者血清干擾素（IFN）-α水平升高，且IFN 驅(qū)動(dòng)的下游基因表達(dá)增高［12］。然而，攜帶PTPN22 突變體LypW 的SLE 患者與非攜帶SLE患者血漿IFN-α水平無(wú)明顯差異，但攜帶LypW的患者產(chǎn)生Toll 樣受體（TLR）7 誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN 能力降低，提示攜帶LypW 的SLE 患者可能存在Toll樣受體或漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞依賴的宿主防御或抗炎功能缺陷［13］。PTPN22 是circ-PTPN22 的親本基因，推測(cè)circ-PTPN22 可能與其親本基因之間有相互作用或者具有類(lèi)似PTPN22的作用。在后續(xù)研究中，我們將對(duì)circ-PTPN22與PTPN22相互作用進(jìn)行深入研究，探索circ-PTPN22的作用機(jī)制，研究circ-PTPN22 或circ-PTPN22pro 蛋白在SLE 中的作用及機(jī)制。

志謝陸軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室楊玓老師和田志強(qiáng)老師；西南醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕免疫科和體檢中心

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突