李 靜，萬九生，鄧衛(wèi)東，陳 超*，岳 銳，黎立光

（1.公安部昆明警犬基地，昆明 650201；2.公安部警犬技術(shù)重點實驗室，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，昆明 650201）

過氧化物酶體增殖激活受體共激活劑也稱為PGC1A（PPARGC1A基因），是由Puigserver 等作為新的轉(zhuǎn)錄共激活劑核受體的PPARG（過氧化物酶體增殖的激活受體），由脂肪細胞的主要調(diào)節(jié)器分化而被檢測到[1]。PPARGC1A做為核受體在轉(zhuǎn)錄適應(yīng)性產(chǎn)熱鏈接中起著關(guān)鍵作用。適應(yīng)性產(chǎn)熱作用在體重調(diào)節(jié)和預(yù)防肥胖中起著重要的作用[2-3]。自適應(yīng)產(chǎn)熱至少包括三個可分離的過程：特異性解偶聯(lián)蛋白（UCP）的表達、呼吸系統(tǒng)線粒體酶的表達鏈和線粒體的生物發(fā)生。PPARGC1A已經(jīng)被證明可以誘導轉(zhuǎn)錄UCP1、UCP2和UCP的mRNA，其啟動子解偶聯(lián)蛋白中含有一個識別位點PPARG 以及THRB[4]。這兩種受體都被激活與PPARGC1A相互作用[5]。過氧化物酶體增殖激活受體α（PPARA）是編碼線粒體脂肪酸β-氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄控制中的關(guān)鍵蛋白，PPARA的調(diào)節(jié)途徑也與肥胖和糖尿病有關(guān)[6]。在肌肉細胞中，PPARGC1A誘導SLC2A4的表達（溶質(zhì)載體家族2 成員4）[7]，小鼠和人PPARGC1A的表達是通過β-腎上腺素受體途徑的冷暴露誘導的[8-9]。人PPARGC1A活性的調(diào)節(jié)是通過與阻遏物的MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）敏感相互作用來控制的[10]。PPARGC1AmRNA已在高能量需求且富含脂肪的組織中發(fā)現(xiàn)，如心臟、骨骼肌、褐色脂肪、腎臟、肝臟和大腦[11-13]。考慮到PPARGC1A蛋白的多功能該基因可視為肉品質(zhì)性狀的功能候選基因[3]。

目前國內(nèi)外主要PPARGC1A基因針對的研究多集中在人、豬、牛上，犬上研究的較少。鑒于此，本研究以昆明犬為研究對象，采用RT-PCR技術(shù)通過對昆明犬PPARGC1A基因克隆的分析，確定PPARGC1A的序列，進行生物信息學分析，為警犬的肌肉形成機理和產(chǎn)能等影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

以公安部昆明警犬基地昆明犬為研究對象。試驗采集于。犬只麻醉后，選擇1歲昆明犬臀大肌取一小塊組織塊于1.5 mL 凍存管中，立即置于液氮中，隨后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于RNA 的提取。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試驗器材

Eppendorf 各量程移液器、湘儀L550 低速大型離心機、湘儀H1650-W 小型高速離心機、君意JY04S-3C 凝膠成像儀、君意JY02 紫外透視儀、君意JY300C 電泳儀、ABI 2720 PCR 儀、ABI 3730xl遺傳分析儀、博日HB-T2-D 金屬浴加熱儀，天平、漩渦震蕩儀、水平震蕩儀，槍頭，96孔反應(yīng)板等。

1.2.2 試驗試劑

I- 5 2X High- Fidelity Master Mix（Tsingke；TP001-1）、Tsingke Agarose、DNA 凝膠回收試劑盒、DL2000 Marker、pClone007 Versatile Simple Vector Kit、瓊脂糖、蛋白胨、酵母粉、TBE、EB、無水乙醇、BDT 原液、buffer（BDT 稀釋用）、甜菜堿、滅菌高純水、樣品、稀釋過的引物、無菌高純水、Magical Buffer、Ferrite Bead。

1.3 引物設(shè)計與合成

參 考GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中PPARGC1A基因序列（登錄號：XM_014112658.2）cDNA 引物，用Premier 5 設(shè)計出擴增引物1對。由擎科生物合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 總RNA的提取

取適量液氮研磨成粉的樣品到1.5 mL eppen?dorf管，加入1 mL Trizol試劑，混勻；按TRIzol：氯仿5:1 的比例加入氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置3 min；4 ℃，12 000 r·min-1，離心15 min；吸取上清至另1新的1.5 mL eppendorf管，加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置20 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min 后，去上清；加入至少1 mL 4 ℃預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀；4 ℃，10 000 r·min-1離心5 min，棄上清；4 ℃，10 000 r·min-1再次離心5 min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥）；加入20 μL RNase-free水，至完全溶解，取1 μL進行電泳檢測。

1.5 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA產(chǎn)物

以擎科金牌逆轉(zhuǎn)率試劑盒Goldenstar RT6 cD?NA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄擴增，按表2組分進行加樣。

表2 PCR反應(yīng)體系

以上加樣混勻后按以下程序進行反轉(zhuǎn)錄：

25 ℃，10 min

50 ℃，30 min

85 ℃，5 min

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上或冷藏備用。

1.6 PCR擴增

PCR 反應(yīng)體系為25.0 μL，其中含DNA 模板1 μL、酶mix25 μL、正反向引物（10 μmol·L-1）各2 μL。PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，退火10 s，72 ℃延伸10 s，30 個循環(huán)，72 ℃后延伸5 min。

1.7 PCR產(chǎn)物切膠純化步驟

試驗準備：核對切膠記錄與樣品板中是否相符、有無特殊注意事項；確保Buffer W1、Buffer W2中加入了無水乙醇。

操作步驟：補水加loading buffer：按照（樣品：6×Loading buffer=5:1）加入10 μL 6×Loading buffer。

點純化膠：將樣品點入事先準備好的1%的純化膠中。

電泳：電泳儀電壓設(shè)定160 V接上接頭正負極恒壓電泳40～60 min，開始電泳后要觀察純化膠槽正負極有氣泡冒出后，定時。

采集圖像：將膠塊放入凝膠成像儀器中采集圖像。

切膠：在長波365 nm 紫外透射儀下，用手術(shù)刀切下目的條帶，切取的膠塊質(zhì)量應(yīng)<3 g，將其放入對應(yīng)的板孔號中。

溶膠： 純化板配平4 000 r·min-1離心1 min，加入500 μL Buffer GL，蓋上封口膜，65 ℃水浴12～15 min。

加磁珠：檢查每孔膠塊是否完全溶解，若沒有完全溶解再次65 ℃水浴3 min，揭開封口膜，用連續(xù)加液器每孔加入10 μL 混勻的磁珠，蓋上硅膠墊，漩渦震蕩30 s，轉(zhuǎn)入水平震蕩儀600～800 r·min-1震蕩5 min。

純化：

①將96 孔板卡入磁力架中，磁吸30 s，將磁力架和樣品正反輕微顛倒3次，再次靜置磁吸1 min；

②棄廢液，吸水紙上輕磕，用50～1 200 μL 8道電動移液器向每孔移取500 μL Buffer W1，蓋上硅膠墊漩渦震蕩30 s，將96 孔板卡入磁力架中，磁吸30 s，將磁力架和樣品正反輕微顛倒3次，再次靜置磁吸1 min；

③棄廢液，吸水紙上輕磕，用50～1 200 μL 8道電動移液器向每孔移取500 μL Buffer W2 蓋上硅膠墊漩渦震蕩30 s，將96 孔板卡入磁力架中，磁吸30 s，將磁力架和樣品正反輕微顛倒3次，再次靜置磁吸1 min；

④棄廢液，吸水紙上輕磕，倒離心至600 r·min-1。

洗脫：取下磁力架，加入35 μL 的Eluent（已65 ℃水浴加熱），蓋上封口膜，放入水平震蕩儀上600～800 r·min-1，震蕩5 min，震蕩完成后離心至1 000 r·min-1，將96孔板卡入磁力架中，磁吸1 min。

點鑒定膠：2 μL樣品+6 μL 0.5×溴酚藍混合后點入0.8%的鑒定膠中，300 V電泳12 min。

采集圖像：將鑒定膠放入凝膠成像儀中采集圖像。

鑒定：對照純化前后膠圖，根據(jù)PCR 定量標準在PCR 記錄表上標注每孔模板濃度并稀釋至指定濃度。

1.8 克隆及測序

連入載體：連接反應(yīng)體系：其中含有5×pClone007 VS mix2 μL，PCR 產(chǎn)物8 μL，ddH2O 補至10 μL。

連接反應(yīng)：室溫（22～30 ℃）反應(yīng)1～5 min。

轉(zhuǎn)化：

①使用擎科TreliefTM5α Chemically Competent Cell進行快速轉(zhuǎn)化。

②取100 μL 冰上融化的TreliefTM5α Chemical?ly Competent Cell 感 受 態(tài) 細 胞， 加 入10 μL pClone007 VS連接產(chǎn)物，輕輕吹打攪拌混勻后冰上靜置5 min。

③42 ℃水浴熱激45 s，迅速移至冰浴中，靜置2 min。

④涂布平板：向離心管中加入500 μL 無抗性LB 培養(yǎng)液，無需復蘇，根據(jù)實驗要求直接吸取不同體積均勻涂布到含Amp 抗生素的LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。

⑤挑取單克?。喊凑Ｌ幚砥桨宓牟襟E挑取單克隆，搖菌提質(zhì)粒。

擴增鑒定后挑選出含有正確目的基因的菌液，送往擎科生物公司進行測序。

1.9 生物信息學分析

用ContigExpress拼接測序結(jié)果。

用拼接好的結(jié)果在NCBI 里比對查找出Homo sapiens人、Mus musculus小家鼠、Mus caroli卡氏小鼠、Sus scrofa歐亞野豬、Bos mutus野牦牛、Bos taurus牛、Canis lupus familiaris家犬、vulpes赤狐PPARGC1A基因序列。

將查找到的序列用BioEdit 進行格式轉(zhuǎn)換，并用clustalx對測序結(jié)果進行比對。

將比對結(jié)果用MEGA的Neighbor Joining模式構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對樹進行編輯優(yōu)化。

將所有序列用MegAlign進行同源性比對。

多序列比對分析利用BioEdit 軟件進行，開放閱讀框分析通過在線分析工具ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）實現(xiàn)。

利用NCBI 服務(wù)器上的Conserved Domains 的CD-Search工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc?ture/cdd/ wrpsb.cgi）獲取蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。蛋白的理化性質(zhì)分析（相對分子質(zhì)量、理論pI值、氨基酸組成及半衰期等）通過在線軟件ExPASy-Prot?Param 工具（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測。疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動力，蛋白的疏水性分析通過ExPASy-ProtScale 工具（https：//web.expasy.org/protscale/）進行。信號肽分析通過在線分析工具Signal P 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行。亞細胞定位與蛋白質(zhì)功能存在重要的聯(lián)系，亞細胞定位分析通過在線分析工具PSORT II（https：//psort.hgc.jp/form2.html）進行。使用TMHMM 軟 件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對蛋白進行跨膜預(yù)測。利用SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）預(yù)測的IGF-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用瑞士生物信息研究院（Swiss Institute of Bioinformatics,SIB）的專業(yè)蛋白分析系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy）服務(wù)器（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆明犬PPARGC1A基因的克隆

提取昆明犬肌肉組織總RNA，并反轉(zhuǎn)構(gòu)成cDNA，經(jīng)過PCR 鑒定（1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 、45 min）電泳觀察發(fā)現(xiàn)，片段大小約2 246 bp（見圖1），與預(yù)期結(jié)果一致，說明引物特異性良好，可以進行下一步研究。

2.2 昆明犬PPARGC1A 基因的同源性比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

測序結(jié)果顯示，昆明犬PPARGC1A基因cds 區(qū)全長2 246 bp，共編碼個724 個氨基酸。運用MegAlign 對昆明犬和其他物種進行同源性比對，結(jié)果與家犬（登錄號：XM_014112658.2）、赤狐（登錄號：XM_025997319.1）、野牦牛（登錄號：XM_005897079.2）、牛（登錄號：NM_177945.3）、人（登錄號：NM_013261.5）、家鼠（登錄號：NM_008904.2）、 卡 氏 小 鼠（ 登 錄 號： XM_021162167.2）、 歐 亞 野 豬（登 錄 號： NM_213963.2）、同源性分別為100%、99.6%、95%、95%、95.4%、91.7%、91.6%、95%（見圖2）。

圖1 昆明犬PPARGC1A基因PCR擴增產(chǎn)物電泳

圖2 昆明犬PPARGC1A基因與其他物種同源性比對

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果，與家犬、赤狐聚為1支，與其他養(yǎng)脊椎動物相分離，表明其在進化上與犬類的親緣關(guān)系較近。與豬、牛、人關(guān)系次之，與小鼠關(guān)系最遠，該基因在哺乳動物中較為保守（見圖3）。

2.3 PPARGC1A基因編碼氨基酸理化特性的分析

根據(jù)在線軟件ExPASy-ProtParam 預(yù)測結(jié)果顯示，PPARGC1A基因編碼蛋白的分子質(zhì)量80 971.82 ku，理論等電點pI 為11.20。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp + Glu）：30 個，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg +Lys）：100 個，表示這個蛋白可能帶正電荷。分子式為C3549H5835N1069O997S48，原子總數(shù)：11 498。序列的N 端是W（Trp），預(yù)計半衰期：2.8 h（哺乳動物網(wǎng)織紅細胞，體外）>3 min（酵母，體內(nèi)）>2 min（大腸桿菌，體內(nèi)）。不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為59.16，這表明PPARGC1A基因編碼蛋白質(zhì)分類為不穩(wěn)定的。脂肪指數(shù)81.60，平均親水系數(shù)為（GRAVY）：-0.336，表明此蛋白親水性差，脂溶性強。在組成昆明犬PPARGC1A基因編碼20 種氨基酸中，亮氨酸Leu（L）占比最高為11.3%。

2.4 昆明犬PPARGC1A蛋白疏水性分析

PPARGC1A蛋白的疏水性分析結(jié)果見圖4。

圖3 昆明犬PPARGC1A基因與其他動物的系統(tǒng)發(fā)生樹分析

表3 昆明犬PPARGC1A基因編碼氨基酸組成分析

圖4 中分值>0 表示氨基酸疏水，<0 表示氨基酸親水，氨基酸分值越高疏水性越強，分值越低親水性越強，昆明犬PPARGC1A蛋白在第683氨基酸處具有疏水最大值3.15636，在第627 氨基酸處具有疏水最小值-2.956。

2.5 昆明犬PPARGC1A蛋白亞細胞結(jié)構(gòu)定位

昆明犬PPARGC1A 蛋白亞細胞結(jié)構(gòu)定位見表4。

表4 昆明犬PPARGC1A蛋白亞細胞結(jié)構(gòu)

2.6 昆明犬PPARGC1A 蛋白跨膜信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用Signal P 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/servic?es/SignalP/）在線預(yù)測，D=0.45是區(qū)分是否是信號肽的標志，昆明犬PPARGC1A 蛋白預(yù)測D 值=0.629，因此是一個分泌性蛋白，預(yù)測的信號肽剪切位點在第23和24位氨基酸之間（見圖5）。

利用在線TMHMM-2.0分析發(fā)現(xiàn)PPARGC1A蛋白存在1 個跨膜結(jié)構(gòu)（見圖6）?？缒の恢锰幱诘?66 和第688 位氨基酸處，前665 位氨基酸處于膜外，第689至724位氨基酸處于膜內(nèi)。

2.7 昆明犬PPARGC1A蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

由圖7可知，利用SOPMA程序預(yù)測PPARGC1A蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，共724 個AA 中含α 螺旋（Hh）203AA（28.04%），延伸鏈（Ee）120個AA（20.99%），β轉(zhuǎn)角（Tt）49 個AA（6.77%）和無規(guī)則卷曲（Cc）352個AA（48.62%），昆明犬PPARGC1A蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖8，全局模型質(zhì)量估計值為0.64，序列相似性為65.73%，認為所建立的三維結(jié)構(gòu)模型較為準確。

圖5 昆明犬PPARGC1A蛋白的信號肽預(yù)測

圖6 昆明犬PPARGC1A蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖7 利用SOPMA程序預(yù)測的昆明犬PPARGC1A蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖8 預(yù)測昆明犬PPARGC1A蛋白的三級結(jié)構(gòu)

3 討 論

過氧化物酶體增殖激活受體伽瑪共激活劑1-alpha（PPARGC1A）是一個在肌肉和脂肪形成中起著關(guān)鍵脂質(zhì)代謝作用的候選基因[14]?？刂埔粋€基因陣列的表達從而影響葡萄糖和脂肪酸代謝[15]。該基因大量存在于肌肉、棕色脂肪和大腦以及有助于脂肪生成和脂肪細胞分化組織[16-18]。身體的肥胖是由于食物攝入和能量消耗之間的不平衡造成的。適應(yīng)性生熱響應(yīng)、低溫和過度進食可能導致肥胖。Puigserver P 將小鼠持續(xù)暴露于低溫環(huán)境，增強適應(yīng)性生熱響應(yīng)（BAT）和Pgc1 mRNA的表達。小鼠白色脂肪細胞中Pgc1的表達誘導UCP1基因轉(zhuǎn)錄激活表達UCP1，UCP 基因家族的成員僅在BAT 中使用，并通過耗散跨內(nèi)線粒體膜的電化學梯度來進行ATP 合成，產(chǎn)生熱量[19]。對嚙齒動物的研究表明，體內(nèi)脂肪儲存可以調(diào)節(jié)[20]。成年人類沒有明確定義的BAT 沉積物，但UCP1 mRNA 表達在白色脂肪組織中也可以檢測到，表明棕色脂肪細胞散布在白色脂肪細胞中。

為進一步了解PPARGC1A 在UCP1 和其他線粒體組織特異性表達中的作用蛋白質(zhì)及其影響犬的肌肉形成機理和產(chǎn)能等，本研究獲得了昆明犬的PPARGC1A 基因cDNA 序列。昆明犬PPARGC1A 基因全長2 246 bp，共編碼個724 個氨基酸。與參考序列家犬（登錄號：XM_014112658.2）同源性為100%。與赤狐（登錄號：XM_025997319.1）、野牦牛（登錄號：XM_005897079.2）、牛（登錄號：NM_177945.3）、人（登錄號：NM_013261.5）、家鼠（登錄號：NM_008904.2）、卡氏小鼠（登錄號：XM_021162167.2）、歐亞野豬（登錄號：NM_213963.2）、同源性分別為99.6%、95%、95%、95.4%、91.7%、91.6%、95%。昆明犬PPARGC1A基因編碼蛋白的分子質(zhì)量為80 971.82 ku，理論等電點pI 為11.20。人的PPARGC1A 基因跨越67 kb 的區(qū)域，由13個外顯子組成，并編碼一種91-ku蛋白質(zhì)，與鼠具有94%的氨基酸同源性。 人類中已轉(zhuǎn)錄的mRNA 種類來自無TATA 啟動子的序列分別為6.4和5.3 kb，被映射到染色體4p15.1[14]。豬PPARGC1A基 因（GenBank NO. NW_003540975.1 和 NM_213963.1）定位于8 號染色體以下位置的p2.1-p2.3，包含13 個外顯子，其90 bp 為50-UTR。編碼區(qū)大小為2 388 bp，編碼796 個氨基酸[21-22]。豬PPARGC1A 基因編碼的氨基酸序列與人類，大鼠，小鼠的同源性也較高。該基因在上述物種中高度同源性物種強烈暗示著該基因編碼不同的生物體作為適應(yīng)熱原中的核心蛋白[23-25]。平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.336，表明此蛋白親水性差，脂溶性強。在組成昆明犬PPARGC1A 基因編碼20 種氨基酸中，亮氨酸Leu（L）占比最高，比例為11.3%。本研究還利用生物信息學分析工具對昆明犬PPARGC1A 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，含α 螺旋、延伸鏈、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。這些結(jié)果為進一步研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能及用于昆明犬分子育種打下良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用分子克隆技術(shù)獲得了昆明犬PPARGC1A基因的編碼區(qū)序列并進行序列分析，以期為進一步研究昆明PPARGC1A基因的表達調(diào)控及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對昆明犬的重要功能奠定一定的基礎(chǔ)。