劉明東，劉小波，趙英杰，張 燕，張慧慧，李福彬

上海交通大學基礎醫(yī)學院免疫學與微生物學系，上海市免疫學研究所，上海200025

單克隆抗體免疫治療是一種新興且十分有效的腫瘤治療方法。以抗細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白 -4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4）抗體和程序性死亡受體 -1（programmed death-1，PD-1）抗體為代表的免疫檢查點抑制型抗體已經(jīng)被廣泛應用于臨床，James P. Allison 和Tasuku Honjo 作為主要貢獻者被授予2018 年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。然而，免疫檢查點抑制型抗體在臨床治療中存在部分患者無效以及出現(xiàn)嚴重不良反應等問題[1-2]，亟需進一步研發(fā)其他治療手段。作用于免疫共刺激分子，如腫瘤壞死因子受體超家族成員5（tumor necrosis factor receptor superfamily member 5，CD40）、 腫 瘤 壞死因子受體超家族成員4（tumor necrosis factor receptor superfamily member 4，OX40）的激動型抗體被認為是一類具有廣泛潛力的抗體，它們能夠激活免疫檢查點的細胞信號通路[3-4]，進而激活免疫細胞增加免疫系統(tǒng)的反應性，發(fā)揮抗腫瘤作用。但是目前激動型抗體尚未被成功應用于臨床，需要進一步研發(fā)。為此，構建能夠有效評估抗體活性的動物模型成為關鍵。

OX40 是一類表達在T 細胞上的共刺激分子[5-6]，屬于腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）。激活T 細胞上的OX40 能夠明顯促進T 細胞增殖，提高T 細胞的反應活性[7-10]。2000 年，Weinberg 等[11]首次在小鼠體內(nèi)驗證了抗OX40 抗體的抗腫瘤作用。雖然目前已經(jīng)有數(shù)種抗OX40 抗體藥物進入了臨床試驗階段[12]，但抗OX40 抗體的抗腫瘤機制并未被完全闡明。一般認為，抗OX40 抗體可直接激活效應T 細胞的OX40 信號通路，提高免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[11]。近年來有研究[13]表明，抗OX40 抗體分子可以通過結(jié)合活化型Fcγ 受體（Fcγ receptor，F(xiàn)cγR）來清除腫瘤微環(huán)境中高表達OX40 的調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg 細胞），解除Treg 細胞對于免疫應答的抑制。也有學者認為，作用于TNFRSF 成員的抗體可能會通過抑制型FcγR 來激活靶點分子的信號通路[13-14]。因此，一個適合抗人OX40 抗體實驗的小鼠模型除了要表達人源化的OX40分子，應該同時表達人源化的FcγR。

目前，用于研究適用于人類靶點分子的人類激動型抗體的小鼠模型主要有靶點分子人源化小鼠、人源化小鼠（接受了人類免疫細胞移植的免疫缺陷小鼠）、靶點分子和FcγR 人源化的小鼠，這幾種模型具有不同的特點。靶點分子人源化小鼠由于只是將靶點分子進行了人源化，獲取相對簡單，但是因為小鼠體內(nèi)沒有人源化的FcγR，所以靶點分子人源化小鼠并不能為人類激動型抗體發(fā)揮作用提供完整的環(huán)境。人源化小鼠體內(nèi)存在人類的免疫細胞，理論上可以滿足人類激動型抗體的作用條件，但是受體小鼠本身存在免疫缺陷，并且人類免疫細胞和小鼠免疫細胞生存和發(fā)育條件有很大的差異性，所以不能保證人類免疫細胞在小鼠體內(nèi)正常發(fā)生免疫應答[15]。只有當與抗體直接結(jié)合的靶點分子OX40 和FcγR 人源化了，抗體的工作環(huán)境才更接近人體環(huán)境，因此構建OX40/FcγR 多基因人源化小鼠模型研究抗人OX40 抗體很有必要。OX40/FcγR 多基因人源化小鼠不但可以為人類激動型抗體提供完整的結(jié)合位點，并且擁有健全的免疫系統(tǒng)[16]，是目前研究人類激動型抗體最為理想的模型。但是由于FcγR 人源化涉及的基因較多，基因型為Fcgrα-/-/Fcgr1-/-/hFCGR1+/hFCGR2A131R+/hFCGR2B+/hFCGR3A158F+/hFCGR3B+[16][Fcgrα 為編碼小鼠Fcγ 受體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的α 鏈的基因，F(xiàn)cgr1 為編碼小鼠Fcγ 受體Ⅰ的α 鏈的基因；hFCGR1、hFCGR2A131R、hFCGR2B、hFCGR3A158F、hFCGR3B 分別為編碼人類Fcγ 受體Ⅰ、ⅡA（131R）、ⅡB、ⅢA（158F）、ⅢB 的α 鏈的基因]，使得這種小鼠難以通過常規(guī)的雜交繁殖法快速構建。為了能夠快速獲得OX40/FcγR多基因人源化小鼠，本研究初步驗證了骨髓嵌合法的可行性。通過骨髓細胞嵌合法建立的OX40/FcγR 多基因人源化小鼠模型擁有相對正常的免疫系統(tǒng)，可同時提供人源FcγR 和人源OX40 分子，并且模型小鼠制作過程簡單、耗時短，可以較好地滿足人類激動型抗人OX40 抗體的腫瘤治療研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

C57BL/6 野生型小鼠，雌性，8 ～10 周齡，體質(zhì)量20 ～25 g，購自上海靈暢生物技術動物有限責任公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2018-0003；mFcγR-/-hFcγRtg轉(zhuǎn) 基 因 小 鼠（Fcgrα-/-/Fcgr1-/-/hFCGR1+/hFCGR2A131R+/hFCGR2B+/hFCGR3A158F+/hFCGR3B+） 由 美 國Rockefeller大學Jeffrey V. Ravetch 教授惠贈；hOX40tg轉(zhuǎn)基因小鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2014-0002。以上小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院實驗動物科學部SPF 級動物房，使用許可證號為SYXK（滬）2018-0027。所有實驗動物相關操作均獲得上海交通大學醫(yī)學院實驗動物使用和管理委員會 批準。

流式細胞實驗中使用的抗體信息見表1。人類抗人OX40 抗體A、人類抗人OX40 抗體B、DEC-OVA 蛋白［抗DEC205 抗體和卵清蛋白（OVA）的融合蛋白，用于提呈OVA 抗原］均購自信達生物制藥有限公司。紅細胞裂解液、蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑Brefeldin A 購自上海碧云天生物技術有限公司，人IgG 同型對照抗體購自美國BioLegend公司，青鏈霉素購自北京四季青生物科技有限責任公司，SIINFEKL 抗原肽購自美國BioLegend 公司，抗CD28 抗體、抗CD3 抗體購自美國BD 公司。

表1 流式抗體列表Tab 1 List of antibodies for flow cytometry

1.2 實驗方法

1.2.1 骨髓嵌合小鼠的制備方法 取8～24周齡的mFcγR-/-hFcγRtg轉(zhuǎn)基因小鼠或者hOX40tg轉(zhuǎn)基因小鼠。處死后，取小鼠股骨、脛骨。用剪刀去除骨的兩端。用1 mL 注射器吸取無菌PBS 緩沖液，反復沖洗骨髓腔中的骨髓至六孔板中。用孔徑70 μm 細胞濾網(wǎng)過濾骨髓細胞懸液，將骨髓細胞懸液移至15 mL 離心管中400×g 離心5 min。棄去上清液，向離心管中加入4 mL 紅細胞裂解液，置于冰上裂解紅細胞。5 min 后，向離心管中加入10 mL PBS 終止反應。離心管400×g 離心5 min 后，棄上清液，重復操作 2 遍。使用細胞計數(shù)板計數(shù)，將細胞密度調(diào)節(jié)到1×107/mL。 然后將2 種小鼠的骨髓懸液按照1:1 的比例混合。把混合好的骨髓細胞懸液經(jīng)尾靜脈注射到經(jīng)過8 Gy 輻照的8 周齡的C57BL/6 野生型小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射200 μL 骨髓細胞懸液。小鼠正常飲食，飲用水中含有1×青鏈霉素，2 個月后進行實驗。

1.2.2 外周血和脾臟淋巴細胞的采集及處理 通過眼眶采集外周血約100 μL，加入肝素抗凝。處死小鼠，取小鼠右側(cè)腹股溝淋巴結(jié)、脾臟。取下的淋巴結(jié)、脾臟經(jīng)孔徑70 μm 的細胞濾網(wǎng)研磨，在研磨液中加入 1×PBS 溶液制成細胞懸液。外周血和脾細胞懸液采集后均需要使用紅細胞裂解液裂解紅細胞。①hCD32 的檢測：獲取的外周血、脾細胞懸液、淋巴結(jié)細胞懸液使用流式抗體染色。所有抗體均稀釋400 倍使用，染色后的細胞通過流式細胞儀檢測。②γ-干擾素（interferon γ，IFN-γ）的流式檢測：將制備好的脾細胞懸液200 μL 置于96 孔板中，每孔細胞數(shù)為2×106個。向 每 孔 加 入1 μg/mL 抗CD28 抗 體、1 μg/mL SIINFEKL 抗原肽。在細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育1 h 后每孔細胞中加入10 μg/mL 蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑Brefeldin A。繼續(xù)孵育5 h 后根據(jù)流式抗體說明書進行染色。③人源OX40分子表達的流式檢測：將制備好的外周血、淋巴細胞懸液、脾細胞懸液置于96 孔板中，每孔細胞數(shù)為2×106個。用 含 有2 μg/mL 的 抗CD28 抗 體、2 μg/mL 抗CD3 抗 體的培養(yǎng)基200 μL 重懸細胞。將96 孔板置于細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育。48 h 后使用流式細胞術進行檢測。在檢測人源OX40 分子時，使用抗體A 作為一抗，再使用BV421標記的抗hIgG-Fc 流式抗體進行染色。同時使用人類抗人CD40 抗體作為同型對照。

1.2.3 小鼠體內(nèi)的抗體活性檢測 第1 日，將人類抗人OX40 抗體B 和人IgG 同型對照抗體分別與DEC-OVA 蛋白混合，并通過小鼠腹腔（3 只/組）進行注射。其中抗體劑量為每只小鼠250 μg，DEC-OVA 蛋白為每只小鼠5 μg。7 d 后，通過流式細胞術檢測CD4+和CD8+T 細胞的IFN-γ 表達水平以及CD4+T 細胞上的人源OX40 的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件對流式細胞術檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。定量資料以±s 表示。2 組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓嵌合小鼠中hCD32 的檢測

分別將野生型小鼠組（n=3）和骨髓嵌合小鼠組（n=3）的外周血、脾臟及淋巴結(jié)中的免疫細胞應用流式細胞術進行分析，以檢測骨髓嵌合小鼠中人源FcγR 的表達情況。實驗選取人類FcγR 成員中的FcγR Ⅱ A 和FcγR Ⅱ B（統(tǒng)稱hCD32）為代表進行流式細胞檢測。結(jié)果顯示，在骨髓嵌合小鼠的外周血、脾臟和淋巴結(jié)中，有較高比例的髓系細胞（圖1A）和B 淋巴細胞（圖1B）表達hCD32。髓系細胞和B 淋巴細胞分別以CD11b 陽性和B220 陽性的免疫細胞表示。這一結(jié)果說明，骨髓嵌合小鼠可以正常表達人源FcγR 分子。

圖1 骨髓嵌合小鼠體內(nèi)表達人源FcγR 的檢測Fig 1 Detection of hFcγR expression in bone marrow chimera mice

2.2 骨髓嵌合小鼠中人源OX40 的檢測

使用含抗CD3 抗體、抗CD28 抗體的培養(yǎng)基對野生型小鼠（n=3）和骨髓嵌合小鼠（n=3）的脾細胞進行刺激培養(yǎng)。2 d 后，用流式細胞術對脾細胞中CD4+T 細胞和CD8+T 細胞表面的人源OX40 分子進行檢測。結(jié)果顯示，抗體刺激后的脾細胞中有將近50%的CD4+T 細胞和CD8+T 細胞表達人源OX40 分子（圖2）。

圖2 骨髓嵌合小鼠體內(nèi)人源OX40 的檢測Fig 2 Detection of hOX40 expression in bone marrow chimera mice

2.3 檢測人類抗人OX40 抗體對CD4+ T 細胞活性的促進作用

抗體B 為人類抗人OX40 抗體。第1 日，將抗體與DEC-OVA 蛋白的混合液對小鼠（n=3）進行腹腔注射。7 d 后，檢測CD4+T 細胞的IFN-γ 和人源OX40 分子的表達水平，兩者均出現(xiàn)了明顯升高，表明人類抗人OX40 抗體對CD4+T 細胞有明顯的激活能力（圖3）。

圖3 骨髓嵌合小鼠CD4+ T 淋巴細胞活性檢測Fig 3 Detection of activity of CD4+ T lymphocyte in bone marrow chimera mice

2.4 檢測人類抗人OX40 抗體對CD8+ T 細胞活性的促進作用

第1 日，將抗體B 與DEC-OVA 蛋白的混合液對小鼠（n=3）進行腹腔注射。7 d 后，通過檢測CD8+T 細胞的IFN-γ 表達水平分析人類抗人OX40 抗體對CD8+T 細胞的激活水平。實驗結(jié)果表明抗體B 對骨髓嵌合小鼠CD8+T細胞具有明顯的激活能力（圖4）。

圖4 骨髓嵌合小鼠CD8+ T 細胞活性檢測Fig 4 Detection of activity of CD8+ T in bone marrow chimera mice

3 討論

抗OX40 抗體的腫瘤治療效果已經(jīng)在臨床前實驗和臨床試驗中得到了驗證[17-18]。為了繼續(xù)對抗OX40 抗體的腫瘤治療機制進行研究和進一步優(yōu)化抗體的治療效果，迫切需要建立一個擁有健全免疫系統(tǒng)并且表達有人源FcγR 和人源OX40 分子的小鼠模型。結(jié)合現(xiàn)有條件，本研究組獲得這種小鼠模型有2 種方法：一種是通過OX40 人源化小鼠與FcγR 人源化小鼠的不斷回交獲得；另一種是通過將骨髓嵌合的方法獲得，即將人源OX40 分子和人源FcγR的小鼠的骨髓細胞按照1:1 的比例混合，然后通過尾靜脈將骨髓細胞混合液注射到輻照過的野生型小鼠體內(nèi)，形成嵌合小鼠。

通過對比2 種方法的優(yōu)缺點，我們發(fā)現(xiàn)與雜交繁殖法相比，骨髓嵌合法可以在短時間內(nèi)滿足實驗需求，并且組內(nèi)差異更小。這是因為基因型純合小鼠的繁殖率較低，很難在短時間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的實驗用小鼠，并且人源化FcγR 小鼠涉及的基因較多，需要較長的繁殖時間才可以獲得基因型純合小鼠。而作為骨髓嵌合受體的野生型小鼠可以直接從公司大量訂購，能夠節(jié)省大量時間。同時，同一批次的小鼠年齡、性別、生理狀態(tài)非常接近，可以在一定程度上降低無關因素對實驗結(jié)果的影響。雖然骨髓嵌合法的一些實驗操作要求較高，比如尾靜脈注射，但是如果加上實驗操作練習的時間，骨髓嵌合法仍然要比雜交繁殖法高效。此外，已有研究[3]證明這種依賴于FcγR 的抗腫瘤效應為順式作用，即需要通過OX40 分子和FcγR 分子分別表達在不同的細胞上。因此，骨髓嵌合小鼠中人源OX40 分子和FcγR 分子在2 種細胞上的分別表達并不會影響抗體依賴FcγR 發(fā)揮作用。

因為骨髓嵌合法具有一定復雜性，所以我們對模型是否建立成功進行了進一步的實驗驗證。我們首先確認了供體小鼠的人源化分子表達情況。通過流式細胞術檢測骨髓嵌合小鼠脾臟、外周血和淋巴結(jié)中的免疫細胞，我們發(fā)現(xiàn)約50%的B 淋巴細胞和髓系細胞表達人源hCD32。這一結(jié)果表明骨髓嵌合小鼠可以正常表達人源FcγR；同時，骨髓嵌合小鼠的脾臟細胞在經(jīng)過抗CD3 和抗CD28 抗體激活后，CD4+T 細胞和CD8+T 細胞表面會表達高水平的人源化OX40 分子。最后，我們使用了人類抗人OX40 抗體對骨髓嵌合小鼠進行了檢測?？贵wB 在骨髓嵌合小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出了對CD8+T 細胞較強的激活能力。這說明骨髓嵌合小鼠擁有較為完整的免疫系統(tǒng)，可以為人類抗人OX40 抗體發(fā)揮作用提供條件。

綜上所述，本研究成功構建了一種可以模擬人類抗人OX40 抗體的人體作用環(huán)境的OX40/FcγR 多基因人源化小鼠模型。通過骨髓嵌合法獲得的小鼠不僅可以同時表達人源化的OX40 分子和FcγR 分子，擁有類似于人體的抗體作用環(huán)境，而且個體之間在性別、年齡和人類FcγR 基因型（來自相同的骨髓細胞）方面的差異較雜交繁殖法小，且耗時短，為探究不同人類抗人OX40 抗體的作用機制，篩選高效的抗體提供了條件。同時，對于同種類型的其他抗體，如抗CTLA-4 抗體、抗4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9，tumor necrosis factor receptor superfamily member 9）抗體和抗PD-1 抗體，本方法也有應用潛力。今后，對構建其他多基因人源化小鼠的有效性，以及骨髓嵌合小鼠與雜交繁殖策略產(chǎn)生的小鼠之間的差異性將做進一步研究。

參·考·文·獻

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