王淑嫻，宋愛(ài)環(huán)，劉 童，辛美麗，葉海斌，吳海一

(山東省海洋生物研究院 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266104)

潮間帶是低潮線(xiàn)與最大高潮線(xiàn)之間的海陸交互地帶，雖然區(qū)域非常狹窄但卻具有很高的生產(chǎn)力。這里有規(guī)律性的潮汐漲落，多樣化的生境類(lèi)型，顯著的人類(lèi)活動(dòng)，微環(huán)境的變化非常大，因此潮間帶的生物必須具有超強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境的能力。潮間帶具有豐富而獨(dú)特的微生物資源，是微生物聚集的基地，是調(diào)查微生物資源、優(yōu)勢(shì)度及多樣性的重要場(chǎng)所。青島即墨丁字灣位于即墨、萊陽(yáng)和海陽(yáng)三市的交界處，周?chē)簧角瓠h(huán)抱，屬海洋性氣候，但因受五龍河谷地及萊陽(yáng)盆地影響，季節(jié)性變化較大，年平均降水量801.6 mm，其中6-9月占全年降水量的75.5%，4-8月多生大霧，每年12月至次年2月是冰凍季節(jié)[1]。這些獨(dú)特的地理和氣候特點(diǎn)，使得青島即墨丁字灣地區(qū)潮間帶沉積物中微生物資源非常豐富。目前文獻(xiàn)資料里很少有關(guān)于該地區(qū)菌種資源及優(yōu)勢(shì)度的介紹。鑒于此，本研究從采集青島即墨丁字灣潮間帶沉積物樣本入手，通過(guò)沉積物中菌種的分離鑒定和優(yōu)勢(shì)度分析，對(duì)該地區(qū)菌種資源和優(yōu)勢(shì)度展開(kāi)調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品

以山東省青島市即墨區(qū)丁字灣潮間帶作為采樣點(diǎn)(北緯36°32′38″，東經(jīng)120°51′39″)，在不同位置、不同深度采集沉積物樣品，裝入無(wú)菌密封袋，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室分離細(xì)菌。

1.2 試劑和儀器

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA，北京陸橋生物試劑有限公司)、生理生化特性微量發(fā)酵管(北京陸橋生物試劑有限公司)；Premix Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)；基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；引物合成(上海生工)；PCR儀(日本Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(日本Bio-Rad公司)；微量加樣器(Eppendorf公司)。

1.3 菌株分離純化

參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[2]中細(xì)菌分離純化的相關(guān)規(guī)程，將沉積物樣品重懸于無(wú)菌過(guò)濾海水中，用無(wú)菌吸管吸取少量混濁液，涂布于TSA培養(yǎng)基上，30 ℃ 細(xì)菌培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，挑取典型菌落，進(jìn)行分離純化。

1.4 菌落形態(tài)及理化特性檢測(cè)

用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。將純化菌株接種于生理生化特性微量發(fā)酵管中，生理生化反應(yīng)結(jié)果參照伯杰細(xì)菌檢定手冊(cè)[3]和常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[4]，獲得細(xì)菌鑒定結(jié)果。

1.5 16S rRNA測(cè)序分析

以各純化細(xì)菌基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rRNA序列擴(kuò)增的通用引物(見(jiàn)表1)，對(duì)各細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行測(cè)定。PCR反應(yīng)體系為50 μL體系(見(jiàn)表2)，反應(yīng)條件見(jiàn)表3。 吸取6 μL的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳20 min，利用凝膠成像儀觀(guān)察并拍照。剩余PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測(cè)序，登陸NCBI網(wǎng)站將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1 16S rRNA序列擴(kuò)增的通用引物

表2 PCR反應(yīng)體系(50 μL)

表3 PCR反應(yīng)條件

1.6 菌種種類(lèi)優(yōu)勢(shì)度分析

菌種種類(lèi)優(yōu)勢(shì)度計(jì)算公式：

di=Ni/N

式中：N表示所在群落的所有菌株的個(gè)體數(shù)之和，Ni表示菌株i的個(gè)體數(shù)，di表示菌株i占總物種的百分比。

di≥10%為優(yōu)勢(shì)種，1%

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

在丁字灣潮間帶共采集沉積物樣品10份，分離到細(xì)菌66株。

2.2 菌株分類(lèi)鑒定

分離菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。結(jié)合生理生化特征及16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果可知，沉積物樣品中分離到的66株細(xì)菌屬于細(xì)菌域的2個(gè)大系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群：變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)中的2個(gè)科(Vibrionaceae和Bacillaceae))3個(gè)屬(Vibrio、Bacillus和Shewanella)。利用MEGA 4.0軟件中鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(如圖1)。

表4 菌株生理生化及革蘭氏染色試驗(yàn)結(jié)果

2.3 分離菌株的優(yōu)勢(shì)度分析

青島即墨丁字灣潮間帶沉積物內(nèi)地衣芽孢桿菌(12.12%)、枯草芽孢桿菌(22.73%)和蠟狀芽孢桿菌(12.12%)屬于優(yōu)勢(shì)種，其他菌株均為常見(jiàn)種，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬(74.24%)。以上結(jié)果可以體現(xiàn)出青島即墨丁字灣潮間帶生境下一定的菌種資源及特點(diǎn)。具體如表5所示。

表4續(xù)表

表5 丁字灣潮間帶菌種資源及優(yōu)勢(shì)度結(jié)果

3 討論

潮間帶是典型的近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)，它處在陸地和海洋交界的地方，受到陸地和海洋的共同影響，因此與其他海洋環(huán)境明顯不同，所以生物多樣性及生物量極高，環(huán)境變化非常劇烈且周期性強(qiáng)[5]。修復(fù)和保護(hù)潮間帶生態(tài)系統(tǒng)首先需要充分了解和認(rèn)識(shí)我國(guó)潮間帶的生物多樣性，才可以進(jìn)一步利用和開(kāi)發(fā)潮間帶資源。由于潮間帶特殊的地理環(huán)境，陸海源以及人為源的有機(jī)物首先在此發(fā)生反應(yīng)并累積，從而導(dǎo)致潮間帶中含有種類(lèi)極為豐富的微生物。潮間帶沉積物中細(xì)菌資源及多樣性研究也越來(lái)越引起廣大專(zhuān)家學(xué)者的重視。王雅蘋(píng)等[6]研究了黃渤海潮間帶底棲細(xì)菌、真菌的緯度梯度分布規(guī)律，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)潮間帶微生物的多樣性及生態(tài)功能提供了理論基礎(chǔ)。國(guó)外也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在潮間帶沉積物中，含有非常多樣性的古菌，古菌基因占總量的1.6%～4.8%[7]。

本研究從青島即墨丁字灣潮間帶采集沉積物樣品，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化，共分離到細(xì)菌66株，根據(jù)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rRNA基因序列分析，綜合鑒定分離所得細(xì)菌屬于變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)中的3個(gè)屬(弧菌屬、芽孢桿菌屬和希瓦氏菌屬)。青島即墨丁字灣潮間帶沉積物中枯草芽孢桿菌是最大優(yōu)勢(shì)種，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬，這與芽孢桿菌的芽孢結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。芽孢含水量極低，抗逆性強(qiáng)，能經(jīng)受高溫、紫外線(xiàn)，電離輻射以及多種化學(xué)物質(zhì)滅殺等，是生命世界中抗逆性最強(qiáng)的一種結(jié)構(gòu)[8-9]，因此芽孢桿菌能夠適應(yīng)潮間帶劇烈的環(huán)境變化，成為優(yōu)勢(shì)種屬。

與國(guó)外發(fā)達(dá)的海洋國(guó)家相比，我國(guó)的基礎(chǔ)海洋調(diào)查工作處于嚴(yán)重滯后的狀態(tài)，國(guó)內(nèi)在海洋微生物方面的研究薄弱，對(duì)潮間帶微生物資源的研究涉及更少。本文的研究結(jié)果顯示了青島即墨丁字灣潮間帶沉積物中具有較豐富的細(xì)菌資源，并對(duì)其優(yōu)勢(shì)度進(jìn)行了分析，可為該地區(qū)潮間帶的生態(tài)系統(tǒng)研究提供相應(yīng)的參考。