呂小燕，袁漢文,何愛美，楊文秀，張哲華，鄭楚文，李 騫，許巧情

(1.長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.應(yīng)城市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖北 孝感 432400)

斑點(diǎn)叉尾鮰(IetalurusPunetaus)屬鯰形目，鮰科，亦稱溝鯰，其體形較長，無鱗，尾鰭分叉較深，背部淺灰色，腹部乳白色，體兩側(cè)有不規(guī)則淺黑色斑點(diǎn)[1]。斑點(diǎn)叉尾鮰原產(chǎn)于美國，上個(gè)世紀(jì)六十年代開始商業(yè)化成魚養(yǎng)殖，被世界公認(rèn)為最適合加工的優(yōu)質(zhì)淡水養(yǎng)殖品種之一[2]，然而養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病的發(fā)病率不斷上升，造成斑點(diǎn)叉尾鮰大規(guī)模死亡，嚴(yán)重阻礙了斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。斑點(diǎn)叉尾鮰病害常見有細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病等，而細(xì)菌性疾病中主要有腸道敗血癥、腐皮病、爛鰓病以及腸套疊病[3]。對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性病原進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)11個(gè)致死率高的菌株，其中4個(gè)菌株為叉尾鮰愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)，4個(gè)菌株為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)以及未能鑒定的另外3個(gè)菌株[4]。而對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰腸敗血癥病原分離發(fā)現(xiàn)兩株G-短桿菌，經(jīng)鑒定后為致病性叉尾鮰愛德華氏菌。劉禮輝等[5]從斑點(diǎn)叉尾鮰爛鰓中分離出一株(0.3～0.5)μm×(5～10)μm革蘭氏陰性菌，經(jīng)鑒定后為柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)。關(guān)于對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)的尚未見報(bào)道，本研究通過16S rRNA基因序列分析以及藥敏試驗(yàn)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰類志賀鄰單胞菌進(jìn)行分離鑒定，以期為斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性疾病的研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)和生產(chǎn)實(shí)踐中的防治方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年5月斑點(diǎn)叉尾鮰病魚取樣于湖北荊州萬樂源有限公司基地，體長42～50 cm，體重2～3 kg。牛肉膏蛋白胨肉湯培養(yǎng)基(LB)、諾氟沙星、多粘菌素B、頭孢曲松、萬古霉素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、丁胺卡納等30種抗菌藥物藥敏紙片，購自杭州微生物有限公司；dNTP(2.5 mmol·L-1)、EasyTaq酶(5 U·μL-1)、10×EasyTaq Buffer(1.2 mL)，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 將斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行體表消毒后解剖，從脾臟、肝臟、腸等處取樣，接種于富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)12 h，挑選優(yōu)勢(shì)菌落，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察平板上菌落形態(tài)，選擇顏色不同、形態(tài)各異、大小不同的菌落，挑選單菌落，然后培養(yǎng)12 h，進(jìn)行PCR檢測(cè)，連接轉(zhuǎn)化，分子凝膠成像檢測(cè)后測(cè)序。

1.2.2 藥敏實(shí)驗(yàn) 用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法檢測(cè)藥物敏感性，在無菌條件下將病原菌致密劃線接種到普通平板，將各種藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測(cè)定抑菌圈直徑[6]。抑菌圈直徑d>15 mm，為敏感(S)；抑菌圈直徑10 mm

1.2.3 16S rDNA 序列的擴(kuò)增與測(cè)序 PCR反應(yīng)體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer，2.5 μL d-NTP(10 mmol/L)，上、下游引物(F/R，10 μmol/L)各1 μL，0.25 μL r-Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL DNA模板，dd H2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃下預(yù)變性5 min，95 ℃下變性30 s，58 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min 30 s，72 ℃下延伸10 min，共32個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收后，送武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)病主要特征

斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)病前期出現(xiàn)食欲減退，攝食減少，在水面盤旋游動(dòng)，約半小時(shí)后，患病魚浮出水面，對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行檢驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)體表有大量紅點(diǎn)，鰭基部與吻部均有充血現(xiàn)象，體外表皮有黃色不明物質(zhì)，肛門紅腫，腹部鼓起。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，腹部有透明液體流出，肝臟顏色腫大，無光澤，腸道呈充血狀(封三圖1所示)。

2.2 16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)分析結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)武漢擎科生物公司測(cè)序后，用Blast軟件對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA序列比對(duì)，16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析，結(jié)果表明，圖2所示該菌株YZ1010與Plesiomonasshigelloidesstrain聚成一個(gè)分支，序列相似度為100%，親緣關(guān)系最為相近，即判定該菌為類志賀鄰單胞菌。

通過PCR檢測(cè)，得到的片段長度約為1 500 bp，與目標(biāo)的16S rRNA條帶基本一致，電泳結(jié)果如圖3所示。

2.3 類志賀鄰單胞菌對(duì)藥物的敏感性差異

由表2可知，通過采用30種不同藥敏片進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在一定藥劑濃度范圍內(nèi)，藥劑的濃度越高抑菌圈的直徑越大。其中發(fā)現(xiàn)類志賀鄰單胞菌對(duì)呋喃唑酮、頭孢拉定、頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢呋辛5種藥物高度敏感；對(duì)氧氟沙星、頭孢氨芐、哌拉西林等11種藥物中度敏感；對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、羧芐西林等14種藥物不敏感。

表2 不同藥敏片的抑菌效果差異性

2.4 回歸感染實(shí)驗(yàn)

從-80 ℃將保存的分離菌株類志賀鄰單胞菌進(jìn)行復(fù)蘇，于37 ℃培養(yǎng)4～6 h，將菌懸液濃度調(diào)節(jié)為1×101～1×106cfu/mL。取健康的斑點(diǎn)叉尾鮰，進(jìn)行人工感染。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各準(zhǔn)備20尾，每尾注射劑量為0.2 mL，對(duì)照組注射0.2 mL的PBS溶液(無菌的緩沖液)，實(shí)驗(yàn)組注射復(fù)蘇的菌液，依次按照梯度進(jìn)行注射，并且每天觀察2～4次，詳細(xì)記錄斑點(diǎn)叉尾鮰生長情況。

人工感染實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組中注射類志賀鄰單胞菌菌懸液后，濃度在1×101～1×106cfu/mL，死亡率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，濃度越高，斑點(diǎn)叉尾鮰死亡率越高(見表3)。注射PBS的對(duì)照組無死亡現(xiàn)象，也無任何病癥。人工感染后，菌株感染的斑點(diǎn)叉尾鮰，出現(xiàn)反應(yīng)遲緩，不攝食，鰭基部均有充血，肛門紅腫，感染的實(shí)驗(yàn)魚體腔充滿腹水，肝腫大，腸充血。感染后出現(xiàn)的癥狀與自然發(fā)病個(gè)體的癥狀基本相同。

表3 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來，伴隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，由于養(yǎng)殖密度增大、水質(zhì)惡化、投喂方式不當(dāng)?shù)纫蛩?，各種細(xì)菌引起的疾病也逐漸爆發(fā)，其中在魚類增養(yǎng)殖中類志賀鄰單胞菌是引起水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病死亡的常見致病菌。類志賀鄰單胞菌為需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌，在分子水平上與鄰單胞菌(Plesiomonas)屬和變形桿菌(Proteus)屬更為接近，因此類志賀鄰單胞菌劃歸到腸桿菌科，鄰單胞菌屬[7]。研究發(fā)現(xiàn)類志賀鄰單胞菌感染草魚(Ctenopharyngodonidellus)后導(dǎo)致其肌肉糜爛、肝臟有出血點(diǎn)、脾臟腫大、肛門紅腫等[8]，感染金魚(CarassiusauratusLinnaeus)、大鯢(Andriasdavidianus)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、鱘魚(Sturgeons)后也都會(huì)出現(xiàn)膽囊和脾臟腫大、采食量減少、肝臟點(diǎn)狀出血等一系列病癥[9-12]。而在本試驗(yàn)中患病斑點(diǎn)叉尾鮰也出現(xiàn)類似癥狀。在臨床表現(xiàn)上類志賀鄰單胞菌感染的患病魚與常見的赤皮病、腐皮病相似，增加了診斷難度[13]。在回歸感染中，健康斑點(diǎn)叉尾鮰隨著注射類志賀鄰單胞菌菌液濃度減少，死亡尾數(shù)降低，而人工感染后出現(xiàn)的癥狀也與自然發(fā)病個(gè)體的癥狀基本相同。而在草魚、金魚、大鯢、尼羅羅非魚和鱘鑒定出的類志賀鄰單胞菌雖有種屬存在差異，但也表現(xiàn)出類似病癥[8-12]。這可能是病原微生物感染時(shí)，打破了動(dòng)物腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡，而不同品種魚免疫機(jī)制存在差異，類志賀單胞菌感染導(dǎo)致魚類腸道免疫系統(tǒng)發(fā)生變化，從而影響腸道系統(tǒng)免疫功能[14]。

通過以保守的16S rRNA基因序列為基準(zhǔn)，找到序列差異鑒定種屬，不依賴于微生物的分離培養(yǎng)，從而快速且準(zhǔn)確鑒定微生物[15]。本試驗(yàn)中通過PCR檢測(cè)，得到的片段長度約為1 500 bp，與目標(biāo)的16S rRNA條帶基本一致，并且在16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)分離菌株為類志賀鄰單胞菌。這與在類志賀鄰單胞菌感染的黃顙魚擴(kuò)增得到的片段約為1 461 bp結(jié)果相似[16]。

目前環(huán)境污染和細(xì)菌耐藥性是影響水產(chǎn)行業(yè)發(fā)展的重大問題。在患病黃顙魚中分離的菌株類志賀鄰單胞菌，藥敏試驗(yàn)表明該菌對(duì)頭孢哌酮、慶大霉素等敏感，對(duì)四環(huán)素中度敏感，對(duì)苯唑西林、氨芐西林等不敏感[16]。龍?zhí)K等發(fā)現(xiàn)類志賀鄰單胞菌感染的黃顙魚還對(duì)另外先鋒VI、菌必治、舒普深等16種藥物高度敏感，對(duì)青霉素G和氨芐青霉素都不敏感[17]?？梢妼?duì)于同一品種所感染的同一種病原株有多種防治藥物，因此在選擇的時(shí)候要具有針對(duì)性。在患病黃沙鱉幼鱉中分離出的類志賀鄰單胞菌對(duì)菌必治、舒普深、氟哌酸、多粘菌素B和環(huán)丙沙星高度敏感，但對(duì)青霉素G、氨芐青霉素、苯唑青霉素等15種藥物不敏感[18]。在患病雜交鱘中分離的類志賀鄰單胞菌對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、多環(huán)西素4種藥物敏感，對(duì)卡那霉素、阿莫西林、泰樂菌素、復(fù)方新諾明4種藥物耐藥[19]?？梢妼?duì)于同一病原株在不同的養(yǎng)殖對(duì)象上，類志賀鄰單胞菌對(duì)于藥物的敏感性有所不同，這可能與病原來源、養(yǎng)殖環(huán)境、感染途徑不同有關(guān)。因此對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行藥物治療時(shí)，應(yīng)更具有針對(duì)性，從而做到科學(xué)合理用藥，有效防控疾病。在斑點(diǎn)叉尾鮰病害研究上，類志賀鄰單胞菌的致病機(jī)理、致病功能基因、免疫防控等仍是需要重點(diǎn)研究的課題。