劉 杰，賀曉晨，黎姍梅，黃艷華，張振豪，黃德生，楊廷雅，吳偉鋒，梁靜真，黃 鈞

(1.廣西財(cái)經(jīng)學(xué)院，廣西 南寧530003；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣西水生動(dòng)物病害診斷實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧，530005；3.廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 南寧，530022；4.欽州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 欽州，535000；5.防城港市港口區(qū)漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 防城港，538002；6.合浦縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 北海，536100)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦，其養(yǎng)殖業(yè)已成為廣西水產(chǎn)養(yǎng)殖的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，但近年來病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約凡納濱對蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種嗜鹽、無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于蝦、蟹、貝等海產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)以及河口、海洋等環(huán)境中，能引發(fā)對蝦發(fā)生紅體病、爛鰓病、白濁病、急性肝胰腺壞死病等病害以及生長緩慢等癥狀，嚴(yán)重危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。副溶血弧菌也是世界范圍內(nèi)重要的食源性致病菌，其危害性僅次于霍亂弧菌和沙門氏菌[4]。對副溶血弧菌進(jìn)行毒力因子檢測，針對毒力因子進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，在副溶血弧菌流行病學(xué)調(diào)查和凡納濱對蝦病害防治等方面均有重要意義。溶血毒素是副溶血弧菌重要的毒力因子之一，包括不耐熱溶血毒素(tlh)、耐熱直接溶血毒素(tdh)、相對耐熱直接溶血毒素(trh)等，這3種毒素分別由tlh、tdh和trh基因編碼。已有研究表明，tlh在各種來源副溶血弧菌中檢出率高達(dá)82.4%～100.0%；tdh在腹瀉和食品中毒患者分離株的檢出率超過95.0%；而trh在各種來源副溶血弧菌檢出率一般不超過6.0%[5-8]。tlh本身無直接溶血活性，只有當(dāng)卵磷脂存在時(shí)才具有溶血活性[9]。tlh基因在副溶血弧菌中存在廣泛性和種屬特異性，李志峰[9]、趙永剛[10]均對副溶血弧菌tlh基因進(jìn)行了蛋白表達(dá)。對蝦副溶血弧菌病是近年來廣西凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中的常見病之一，但至今鮮見有關(guān)廣西蝦源副溶血弧菌溶血毒素基因攜帶情況的研究報(bào)道。本試驗(yàn)對67株廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌進(jìn)行3種毒力基因tdh、trh和tlh檢測，同時(shí)對tlh基因進(jìn)行了蛋白表達(dá)，旨在查明廣西凡納濱對蝦副溶血弧菌3種溶血素基因攜帶情況，為對蝦副溶血弧菌病的有效防控及弧菌疫苗的研發(fā)、抗tlh單克隆抗體的制備提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

受試菌株為2013年至2016年間分離自廣西欽州、防城港和北海3市養(yǎng)殖凡納濱對蝦的67株副溶血弧菌。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒以及PCR引物購自賽默飛世爾科技公司；pET-28a質(zhì)粒購于云舟生物科技(廣州)有限公司；PVDF膜、Tween-20、Anti-6×His tag(小鼠單克隆抗體)、羊抗鼠IgG(H+L)等均購于索萊寶科技有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH 5α、pMD18-T載體、T4 DNA Ligase、Hind III、EcoRⅠ等均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1tdh、trh和tlh3種毒力基因檢測 參考趙永剛[10]的方法，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系共計(jì)25 μL，包括10 mM dNTPs 1 μL，10 μM的上下游引物各1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，TaqDNA酶(5.0 U/μL)0.5 μL，25 mM MgC123 μL，DNA模板2.0 μL，余下體積由ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR引物的序列、退火溫度以及預(yù)計(jì)片段長度見表1。

表1 PCR反應(yīng)引物序列、預(yù)計(jì)片段長度及退火溫度

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有X-Gal、Amp(氨芐青霉素)、IPTG的LB固體培養(yǎng)基中均勻涂布150 μL。37 ℃培養(yǎng)24 h后挑選白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含有Amp)中，180 rpm振蕩培養(yǎng)12～16 h。以菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將陽性菌液送華大基因進(jìn)行測序。

1.2.2tlh基因的生物信息學(xué)分析 用MEGA軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3tlh基因原核表達(dá)載體構(gòu)建 在tlh基因上下游引物分別加入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind III酶切位點(diǎn)，引物序列如下，F(xiàn): 5'-CGGAATTCATGATGAAAAAAACAATC-3'，R: 5'-CGAAGCTTTTAGAAACGGTACTCGGC-3'。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和連接轉(zhuǎn)化方法同1.2.1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-tlh并送華大基因測序。

將重組質(zhì)粒pMD18-T-tlh和pET-28a載體用EcoRⅠ和HindIII分別進(jìn)行雙酶切，將酶切后的tlh片段與pET-28a載體連接，連接體系為：10×buffer 2 μL，T4 DNA Ligase 2 μL，tlh回收產(chǎn)物和pET-28a載體各5 μL，ddH2O 6 μL，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取150 μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基中(含有卡那霉素、X-Gal、IPTG)。37 ℃培養(yǎng)16～24 h后，挑選白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)(含卡那霉素)，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h左右，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行鑒定。

1.2.4 原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-28a-tlh轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑單個(gè)菌落接種于總體積為5 mL的LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素)，于37 ℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)18～24 h。取過夜培養(yǎng)物10 mL轉(zhuǎn)接于100 mL上述LB液體培養(yǎng)基中。在菌液的OD600值為0.6時(shí)，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG終濃度為0.8 mM。經(jīng)過3～6 h的誘導(dǎo)后，取1 mL菌液離心去上清，加入100 μL高效RIPA細(xì)胞裂解液和1 μL苯甲基磺酰氟，反復(fù)混勻后于冰上放置20 min，離心5 min，收集上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 原核表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE和Western blotting鑒定 取15 μL上清液，向上清液中加入4×Protein SDS PAGE Loading Buffer 5 μL，煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳凝膠在轉(zhuǎn)膜儀中將蛋白轉(zhuǎn)至0.22 μm的PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為10 V、10 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，以TBST溶液洗滌2次，每次5 min；采用封閉液封閉約1 h；用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液按1 000∶1的比例稀釋Anti-6×His tag小鼠單克隆抗體，在4 ℃的搖床上搖約12 h；以TBST溶液洗滌5次；用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液按5 000∶1的比例稀釋羊抗鼠IgG(H+L)，在室溫?fù)u床上搖約1 h；以TBST溶液洗滌5次；加顯色液在暗處顯色2～3 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察顯色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 tdh、trh和tlh 3種毒力基因檢測

經(jīng)PCR反復(fù)多次擴(kuò)增，67株副溶血弧菌均未檢測到tdh和trh2種毒力基因，tlh毒力基因則全部檢出。PCR條帶大小與預(yù)測值接近(見圖1)。將PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，結(jié)果表明，這些陽性條帶均為tlh基因序列。67株副溶血弧菌tlh基因序列之間的相似性為98.9%～100.0%。

2.2 tlh基因生物信息學(xué)分析

序列分析結(jié)果，HJ026、HJ083、HJ102、HJ123、HJ147、HJ172與副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33846的tlh基因序列相似性為99.1%～99.5%?；趖lh基因序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(見圖2)，結(jié)果表明，這6株廣西副溶血弧菌與副溶血弧菌ATCC33846、Vp-18、1937聚為一支，親緣關(guān)系相對較近，與溶藻弧菌(V.alginolyticus)V05和哈維氏弧菌(V.harveyi)vh218的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2.3 tlh基因的蛋白表達(dá)及鑒定

隨機(jī)選取菌株HJ083的基因組DNA為模板、使用含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物進(jìn)行tlh基因擴(kuò)增。將回收的目的片段與pMD18-T載體連接并進(jìn)行轉(zhuǎn)化后送測序。結(jié)果表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-tlh。將pMD18-T-tlh和原核表達(dá)載體pET-28a分別進(jìn)行雙酶切，然后將兩者連接并進(jìn)行轉(zhuǎn)化后送測序。重組質(zhì)粒pET-28a-tlh雙酶切后分別在約5 300 bp和1 200 bp處出現(xiàn)明顯條帶，其中5 300 bp左右與 pET-28a條帶大小相符，1 200 bp左右與tlh基因大小相符(見圖3)。結(jié)合測序結(jié)果證明重組質(zhì)粒pET-28a-tlh構(gòu)建成功。

將pET-28a-tlh轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blotting鑒定。電泳結(jié)果，含pET-28a-tlh、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌其表達(dá)產(chǎn)物在53 kDa左右處出現(xiàn)了一條蛋白條帶，其分子量大小與預(yù)測值接近；含pET-28a-tlh而未經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物則無此特異性條帶，初步判斷目的蛋白tlh-HJ083表達(dá)成功(見圖4)。Western blotting鑒定結(jié)果，抗6×His的單克隆抗體能與tlh-HJ083重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)一步證明tlh-HJ083蛋白表達(dá)成功(見圖5)。

3 討論

弧菌能通過溶血毒素裂解紅細(xì)胞膜，tdh和trh均具有溶血活性、細(xì)胞毒性和腸毒性；tlh本身無直接溶血活性，需要卵磷脂的存在才具有溶血活性[2]。根據(jù)胡夢華[5]、代敏等[6]、謝紅意等[7]、徐奮奮[8]、張海強(qiáng)[2]等學(xué)者對副溶血弧菌的毒力基因的研究結(jié)果，副溶血弧菌的tdh基因在人類臨床分離株中檢出率較高，而在水產(chǎn)品分離株上的檢出率要遠(yuǎn)小于人類臨床分離株，trh基因在水產(chǎn)品分離株和人類臨床分離株的檢出率接近。本試驗(yàn)對廣西欽州、北海和防城港3市67株凡納濱對蝦源副溶血弧菌進(jìn)行tdh、trh及tlh3種溶血毒素基因的檢測，結(jié)果顯示，tdh和trh基因均未檢出，tlh基因檢出率為100.0%，與胡夢華[5]的研究結(jié)果一致，tdh和trh基因的檢測結(jié)果與徐奮奮等[8]對寧波小水產(chǎn)品副溶血弧菌的檢測結(jié)果也相同，但與謝紅意等[7]其他研究者的結(jié)果存在較大差異。這是否與副溶血弧菌的不同來源有關(guān)，尚須作進(jìn)一步的研究。值得關(guān)注的是，已有研究表明，tdh-/trh-/tlh+基因型的副溶血弧菌對小鼠和人類均具有致病性[11]。因此，對于副溶血弧菌的致病性，不能僅根據(jù)菌株是否攜帶tdh或trh基因來判斷，還需對諸如尿素酶、黏附因子等毒力因子進(jìn)行檢測綜合判斷[12]。

弧菌病是對蝦養(yǎng)殖中常見且危害較嚴(yán)重的一類疾病。在弧菌病防治方面，多年來養(yǎng)殖戶主要采用抗生素進(jìn)行治療，但抗生素容易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，也容易引起藥物殘留或環(huán)境污染等問題。因此，弧菌疫苗的研制日益受到人們的重視。在生產(chǎn)實(shí)踐中，如將對蝦幼體轉(zhuǎn)入到含有滅活弧菌的水體中，對蝦的免疫力可維持到蝦體收獲[13]。陳華等[14]克隆了鋸緣青蟹副溶血弧菌的tlh基因，并表達(dá)了其編碼蛋白，以純化的tlh蛋白免疫小白鼠得到血清效價(jià)達(dá)8 000。王榮智[15]成功表達(dá)了副溶血弧菌tlh蛋白，并用純化的tlh蛋白免疫Balb/c小鼠，獲得了血清效價(jià)為16 000的抗血清。本試驗(yàn)采用表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物中的重組蛋白具有6×His標(biāo)簽，6×His標(biāo)簽分子量比較小，在生理?xiàng)l件下不帶電荷，因此幾乎不會(huì)影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。后續(xù)可利用鎳離子和His標(biāo)簽相結(jié)合的性質(zhì)純化目的蛋白。本試驗(yàn)還采用Western blotting法鑒定了tlh-HJ083重組蛋白，發(fā)現(xiàn)重組蛋白能與抗6×His標(biāo)簽的單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)一步證明了tlh-HJ083蛋白表達(dá)成功。本試驗(yàn)成功表達(dá)了廣西蝦源副溶血弧菌tlh重組蛋白，為后續(xù)廣西蝦源副溶血弧菌疫苗的研制、抗tlh單克隆抗體的制備提供了參考，但要將試驗(yàn)結(jié)果成功應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐仍須開展大量的后續(xù)研究。