項(xiàng)孫寰

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

辣椒是許多國(guó)家重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有重要的藥用與食用價(jià)值。辣椒炭疽病嚴(yán)重危害作物生長(zhǎng)，對(duì)作物品質(zhì)、產(chǎn)量有重要影響。炭疽菌侵染辣椒寄主的致病機(jī)制涉及多種轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)雜基因調(diào)控過(guò)程。鋅指類(lèi)蛋白轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因調(diào)控起重要作用。自1831年Corda提出炭疽菌屬（Colletotrichum Corda）后,越來(lái)越多的植保工作者對(duì)炭疽菌進(jìn)行了研究,表明其地理分布和寄主范圍均非常廣泛[1]。炭疽菌菌體較粗大，在有氧、溫度適宜（25℃～30℃）條件下可形成橢圓形芽孢。德國(guó)醫(yī)師兼科學(xué)家羅伯·柯霍（Heinrich Hermann Robert Koch）首先于1870年從人體中分離出炭疽菌，從此生物學(xué)家開(kāi)始對(duì)炭疽菌進(jìn)行深入研究。炭疽菌（anthracis）通常以內(nèi)孢子的形態(tài)出現(xiàn)在土壤里，是一種棒狀的革蘭氏陽(yáng)性菌，可在草莓、蘋(píng)果、辣椒、梨、棗、柑橘和虎耳草等多種植物中引發(fā)疾病，并對(duì)這些植物造成嚴(yán)重危害[2]。炭疽菌主要侵害果實(shí)和葉片,導(dǎo)致果實(shí)整體腐爛,果皮變黑色[3]。植物炭疽病全年均可發(fā)生，主要發(fā)生在植株較大、通風(fēng)不良或管理失當(dāng)時(shí)，但以高溫多濕時(shí)較為嚴(yán)重。林春花等[4]研究表明，炭疽菌主要有膠孢炭疽菌復(fù)合群（C.gloeosporioides species complex）和尖孢炭疽菌復(fù)合群（C.acutatun species complex）,其中C.siamense膠孢炭疽菌復(fù)合群為主要類(lèi)群。研究表明，炭疽菌會(huì)在侵染寄主植物的過(guò)程中合成大量的效應(yīng)蛋白，抑制寄主細(xì)胞的PTI（天然免疫）反應(yīng)，利于病原菌的侵染，說(shuō)明效應(yīng)蛋白在炭疽菌的致病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[5]。據(jù)報(bào)道，膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌均可以引起橡膠樹(shù)炭疽病，但膠孢炭疽菌的致病性遠(yuǎn)強(qiáng)于尖孢炭疽菌的致病性[6]。

炭疽菌中存在許多轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)其轉(zhuǎn)錄過(guò)程具有重要作用。轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)蛋白質(zhì)分子，能與基因的5’端特定序列專一性識(shí)別并結(jié)合，從而保證基因表達(dá)的順利進(jìn)行。生物學(xué)者多以擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子研究，Riechmann等人在擬南芥中鑒定出 1 500 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括 NAC、b-ZIP、Myb/c、WRKY 和AP2/ERF家族，其中對(duì)AP2/ERF家族的研究最為完善[7]，AP2/ERF家族主要特征是具有高度保守的約60～70個(gè)氨基酸組成的AP2結(jié)構(gòu)域[8]。鋅指類(lèi)蛋白是一種具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，由Zn2+與氨基酸整合形成，在基因調(diào)控方面具有重要的意義。1983年，第一個(gè)具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的鋅指蛋白TF3A在爪蟾卵母細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，此后鋅指類(lèi)基因調(diào)控因子蛋白被廣泛研究[8]。根據(jù)鋅指蛋白中組氨酸（His）與半胱氨酸（Cys）殘基個(gè)數(shù)與位置的不同，Berg等[9]將鋅指蛋白分為C2H2、C2HC、C6、C8、C2HC5、C3HC4、C4HC3、C2C2 和 CCCH等9類(lèi)。

本研究著眼于與辣椒炭疽病致病機(jī)制相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子zf-C2H2，利用生物信息學(xué)方法，獲得zf-C2H2的基因家族序列，對(duì)該家族成員進(jìn)行序列比對(duì)，分析其理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、進(jìn)行亞細(xì)胞定位等，為進(jìn)一步解析zf-C2H2對(duì)辣椒炭疽的致病機(jī)理提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 辣椒炭疽zf-C2H2基因家族鑒定及蛋白序列分析

為了鑒定zf-C2H2基因家族成員，首先從NCBI中下載辣椒炭疽全基因組序列，從網(wǎng)站（http://www.transcriptionfavtor.org/Download/pfam_18.dbds.v2.03.txt）中下載Pfam結(jié)構(gòu)域模型。以pfamscan掃描辣椒炭疽全基因組序列，將包含上述pfam domain的辣椒炭疽序列提取出來(lái)。以hmmscan（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan）進(jìn)行預(yù)測(cè)鑒定，確保序列均含有zf-C2H2保守結(jié)構(gòu)域，對(duì)這些序列歸類(lèi)，最終得到19條包含zf-C2H2的基因家族序列。再使用ExPASy-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在線工具計(jì)算相應(yīng)蛋白序列的分子量、等電點(diǎn)和氨基酸數(shù)。使用TargetP（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對(duì)獲得的蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。1.2 zf-C2H2基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI中下載鏈霉菌zf-C2H2蛋白序列，利用MEGA X軟件中的ClustalW功能對(duì)獲得的蛋白質(zhì)序列與辣椒炭疽zf-C2H2蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，將得到的結(jié)果輸入MEGA X軟件中構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，以此對(duì)基因的親緣關(guān)系進(jìn)行探究。

1.3 zf-C2H2蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

辣椒炭疽zf-C2H2蛋白利用 SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)對(duì)zf-C2H2蛋白。利用SWISS-MODLE（https://swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)?；陬A(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 zf-C2H2基因家族保守基序分析

一個(gè)基因家族中共有的motif很有可能是行使相應(yīng)功能的關(guān)鍵序列或是基因家族中必不可少的序列。利用在線工具M(jìn)EME（http://meme-suite.org/tools/meme）對(duì) 19條辣椒炭疽zf-C2H2蛋白的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。軟件參數(shù)motif數(shù)目設(shè)置為8，其余參數(shù)使用默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒炭疽zf-C2H2基因家族成員理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析

本研究從NCBI上下載辣椒炭疽基因蛋白序列，用pfamscan掃描Pfam-A，對(duì)所得80條序列MegAlign軟件預(yù)測(cè)同源性，經(jīng)hmmscan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域鑒定，最后篩選出19條均含有zf-C2H2蛋白二聚區(qū)結(jié)構(gòu)域的辣椒炭疽序列。將鑒定所得基因家族序列按照其基因ID排序從Cg1～Cg19命名。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示（表1），zf-C2H2蛋白的氨基酸數(shù)目在386～985aa，Cg5和Cg11的氨基酸數(shù)目最多；分子量最小的蛋白為Cg2和Cg10（42002.8KD），最大的蛋白為 Cg5（109661.9KD）；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在 6.05～10.04，其中僅 Cg1、Cg5、Cg11、Cg13 的等電點(diǎn)小于7（酸性蛋白），而其他15個(gè)家族成員均為堿性蛋白質(zhì)。通過(guò)亞細(xì)胞定位分析可知，所有zf-C2H2蛋白都定位于細(xì)胞核中，推測(cè)zf-C2H2家族蛋白主要參與核基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

表1 辣椒炭疽zf-C2H2基因家族理化性質(zhì)概況Tab.1 Physicochemical properties of zf-C2H2 gene family of Colletotrichum capsici

2.2 辣椒炭疽菌與鏈霉菌zf-C2H2基因家族進(jìn)化分析

將辣椒炭疽zf-C2H2基因家族成員與鏈霉菌zf-C2H2基因家族進(jìn)行多序列比對(duì)，之后利用MEGA X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖1）。結(jié)果表明，辣椒炭疽zf-C2H2蛋白與鏈霉菌zf-C2H2蛋白家族位于不同分支，推測(cè)二者同源性較低；辣椒炭疽zf-C2H2蛋白分為7個(gè)亞族，第4與第7亞族的蛋白數(shù)量為2，其余亞族均包含3個(gè)蛋白。進(jìn)化樹(shù)顯示，第7亞族（包含Cg5與Cg11）與鏈霉菌親緣關(guān)系接近。

2.3 zf-C2H2基因家族蛋白結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈沿著主鏈骨架的空間布局、規(guī)則性循環(huán)式排列，或某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，與氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象無(wú)關(guān)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)即在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤(pán)曲折疊而形成的三維空間結(jié)構(gòu)，是肽鏈中所有氨基酸殘基的相對(duì)空間布局。對(duì)辣椒炭疽zf-C2H2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明（表2、圖2），二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括4種，即α-螺旋、β-折疊、延伸鏈與無(wú)規(guī)卷曲。其中無(wú)規(guī)卷曲所占比例最高，占57.46%～81.14%；β-折疊所占比例最少，僅占0.97%～4.75%。根據(jù)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析（見(jiàn)圖3），可大致分為4組，一組為Cg1、Cg3、Cg7、Cg12、Cg13、Cg19；一組為 Cg2、Cg9、Cg10；一組為 Cg5、Cg6、Cg8、Cg11、Cg15；一組為 Cg4、Cg14、Cg16、Cg17、Cg18。每一組內(nèi)的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有較高相似性，而組與組之間存在較大差異。

表2 辣椒炭疽zf-C2H2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要組件比例%Tab.2 Proportion of major components of zf-C2H2 protein secondary structure of Capsicum anthracnose

2.4 zf-C2H2基因家族保守基序分析

利用MEME在線工具對(duì)辣椒炭疽zf-C2H2基因家族蛋白進(jìn)行保守基序查找，共搜索到8個(gè)motif（圖4）。各motif的長(zhǎng)度、氨基酸組成以及在家族成員中出現(xiàn)的次數(shù)等信息見(jiàn)表3，其中motif1在19條序列中均存在，而motif6僅存在于5個(gè)家族成員。其中 motif1、motif2、motif3、motif7 的保守性最高，且motif1、motif2、motif3這3種原件普遍存在于19個(gè)成員中。推測(cè)motif1、motif2、motif3、motif7 是辣椒炭疽 zf-C2H2 基因編碼蛋白的重要組件。在同一亞族的zf-C2H2蛋白保守基序組成相似，驗(yàn)證了所鑒定出的辣椒炭疽zf-C2H2基因家族序列的可靠性。

3 討論

鋅指蛋白（如zf-C2H2）轉(zhuǎn)錄因子在自然界中分布廣泛，且在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角色。C2H2型鋅指蛋白是最常見(jiàn)的鋅指蛋白之一,對(duì)真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫的耐受能力都有著重要作用[10]。楊明磊等人[11]在分析煙草C2H2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員時(shí)指出，C2H2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族編碼的轉(zhuǎn)錄因子具有多種生物學(xué)功能，其不僅與DNA、RNA相互作用，還與蛋白質(zhì)相互作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)植物中尤其是擬南芥中的zf-C2H2蛋白分析較多，而對(duì)細(xì)菌內(nèi)存在的zf-C2H2蛋白研究較少。炭疽菌等細(xì)菌通過(guò)寄生作物而導(dǎo)致作物品質(zhì)、產(chǎn)量大幅下降。辣椒具有重要的藥用及食用價(jià)值，研究炭疽菌對(duì)其侵染寄生機(jī)制有助于辣椒種質(zhì)創(chuàng)新與育種改良。本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)辣椒炭疽zf-C2H2基因家族進(jìn)行了鑒定及分析，旨在為炭疽菌中鋅指蛋白參與的基因調(diào)控與寄生機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

表3 基序的氨基酸組成Tab.3 Amino acid composition of motif

本研究用辣椒炭疽全基因組序列比對(duì)pfam結(jié)構(gòu)域，去除掉不含有zf-C2H2結(jié)構(gòu)域的基因，共篩選出19條辣椒炭疽zf-C2H2基因家族序列。通過(guò)對(duì)家族成員蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)zf-C2H2蛋白多為堿性蛋白，以堿性氨基酸為主，其中氨基酸數(shù)量與分子量差異不明顯，表明基因家族成員之間具有相似的理化性質(zhì)，符合基因家族定義的邏輯認(rèn)知。通過(guò)亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)19條序列均位于細(xì)胞核，表明zf-C2H2蛋白主要在細(xì)胞核中起作用，參與遺傳信息表達(dá)與調(diào)控。通過(guò)對(duì)辣椒炭疽zf-C2H2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，其中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)卷曲占比大，其余結(jié)構(gòu)占比小。按各結(jié)構(gòu)類(lèi)型所占比例大小排序?yàn)闊o(wú)規(guī)卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-折疊，表明無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)在zf-C2H2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中起著重要作用，其余結(jié)構(gòu)則起到一定的修飾作用，同時(shí)，高含量的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為解析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及模式增加了難度。分析三級(jí)結(jié)構(gòu)將序列大致分為4組，且同源性高的大多分在同一組，此現(xiàn)象驗(yàn)證了系統(tǒng)進(jìn)化分析。由預(yù)測(cè)生成的三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。近年來(lái)，多基因系統(tǒng)進(jìn)化分析在炭疽菌分類(lèi)研究中得到廣泛應(yīng)用[12-13]，本文通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)辣椒炭疽zf-C2H2基因家族分為7個(gè)亞族，每個(gè)亞族的組成與數(shù)量都存在差異，推測(cè)差異源于基因的復(fù)制與丟失,但各個(gè)亞族之間的差異不明顯，說(shuō)明各亞族進(jìn)化水平相差不大。保守基序分析驗(yàn)證了序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析，并且分析發(fā)現(xiàn)motif1存在所有分析序列中，推測(cè)motif1作為結(jié)構(gòu)域中的亞單元，在結(jié)構(gòu)域發(fā)揮多種生物學(xué)作用中具有重要意義。

目前C2H2型鋅指蛋白在大豆、擬南芥、矮牽牛和水稻中均有較為系統(tǒng)且詳盡的研究,但在其他物種研究方面相對(duì)欠缺。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展以及相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)該分子的研究會(huì)更全面。