韓賓， 魏慧敏， 張舒林， 孟民杰△

1廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院(廣東廣州 510006)； 2同濟大學高等研究院(上海 310106)； 3上海交通大學基礎醫(yī)學院(上海 200025)

呼吸系統(tǒng)疾病在全世界具有最高的病死率，包括慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、肺癌、肺彌漫性間質(zhì)纖維化和肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)。迄今為止，肺癌和肺結核仍然是這些疾病中的世界性難題。根據(jù)組織病理學類型，肺癌可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，NSCLC包括肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)、鱗狀細胞肺癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)、大細胞癌(large cell carcinoma)和基底細胞癌(basal-like cell carcinoma)。全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2018年各類癌癥中肺癌的發(fā)病率和病死率最高[1]。此外，結核病是全球十大死亡原因之一，也是全球單一傳染源的首要原因[2]。不僅如此，PTB在臨床上還容易被誤診為肺癌。盡管多年來對肺癌的研究取得了重大進展，但其發(fā)病率和病死率仍然很高。目前，通過手術治療的肺癌患者的五年生存率為30%～42%，而非手術治療的為4%～12%。肺癌患者各個階段的治療效果也有很大差異。腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)和合理利用可以達到早期發(fā)現(xiàn)肺癌的目的。雖然已經(jīng)有腫瘤標志物在臨床上使用，但是缺乏足夠的敏感度和特異度。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)具有高敏感度和特異度的腫瘤標志物。硒是人體必需的微量元素。它在阻斷細胞周期，促進細胞凋亡，減少細胞增殖，DNA低甲基化[3]，增加谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶的活性[4]，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應[5]和增強DNA修復[6]中起關鍵作用。此外，硒還被認為與降低癌癥風險有關[7-10]。SBP-1是人體中硒的一種存在形式。研究表明，硒可能以共價鍵的形式存在于SBP-1中，其結合位點位于第57個半胱氨酸上[11-12]。也有研究表明，SBP-1是一種與口臭有關的甲硫醇氧化酶，參與了甲硫醇的代謝過程[13]。另外，與肺癌、肝癌、食管癌、子宮平滑肌瘤、乳腺癌和惡性黑色素瘤等許多癌癥相比，SBP-1的表達較正常人降低[14-21]。但是，基于先前對肺腺癌組織樣品進行蛋白質(zhì)組學研究的結果，我們發(fā)現(xiàn)與匹配的癌組織相比，SBP-1蛋白在肺腺癌組織中表達上調(diào)。因此，我們進一步證實了這一結果，并觀察LUAD中SBP-1蛋白是否上調(diào)。

1 資料與方法

1.1 樣本及試劑 在先前的蛋白質(zhì)組學研究中，我們于2011年4月至2011年8月從河南大學第一附屬醫(yī)院收集了18例LUAD組織和配對癌旁組織，作為發(fā)現(xiàn)組樣本，病例均經(jīng)病理學診斷。2018年10月至2019年3月從上海市公共衛(wèi)生臨床中心病理科收集36例NSCLC組織切片，包括23例肺腺癌和13例肺鱗癌；21例肺結核組織切片，其中12例痰涂片陽性結核(P-PTB)和9例痰涂片陰性(N-PTB)的患者，作為驗證組樣本，所有樣本均由病理專家檢查。樣本的詳細臨床信息如表1所示。本研究是在上海市公共衛(wèi)生臨床中心倫理審查委員會的批準下進行的，所有參與者均簽署了知情同意書。倫理道德已經(jīng)認證(2019-S009-02)。

表1 肺癌組織樣本(發(fā)現(xiàn)組)和石蠟切片樣本(驗證組)臨床信息 例(%)

鼠源抗人SBP-1單克隆抗體(日本MBL)購自MEDICAL&BIOLOGICAL LABORATORIES CO，LTD。帶有FITC標記的驢抗小鼠多克隆抗體和HRP標記的山羊抗小鼠多克隆抗體購自英國Abcam公司。ImmPACTTM DAB過氧化物酶底物購自VECTOR LABORATORIES。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光 使用超高分辨率激光掃描共聚焦顯微鏡，通過免疫熒光法對36例NSCLC患者和21例PTB患者進行SBP-1的細胞定位。用二甲苯和濃度梯度遞減的乙醇分別對切片進行脫蠟和水化處理。在高溫條件下用枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0，碧云天)抗原修復。自然冷卻至室溫后，用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌3次。在室溫下使用5%正常驢血清封閉1 h，然后使用抗人SBP-1單克隆抗體(MBL，日本)以1∶200稀釋度孵育1 h，然后使用PBS緩沖液洗滌3次。通過使用帶有FITC標記的驢抗小鼠多克隆抗體(Abcam，UK)以1∶100稀釋度避光孵育1 h。用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌3次后，用DAPI染色確定細胞核的位置，并用抗熒光猝滅劑封片。隨后，用超高分辨率激光掃描共聚焦顯微鏡(德國LEIKA TCS SP8 STED)獲得數(shù)字圖像。

1.2.2 免疫組化 通過免疫組織化對36例NSCLC患者和21例PTB患者進行了SBP-1表達水平的測定。分別使用二甲苯和濃度梯度遞減的乙醇對切片進行脫蠟和水化，然后使用過氧化氫溶液(BOSTER，美國)避光孵育10 min。在高溫條件下用枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0，碧云天)抗原修復。自然冷卻至室溫后，用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌3次。在室溫下使用5%正常山羊血清封閉1 h，然后使用小鼠抗人SBP-1單克隆抗體(MBL，日本)以1∶500稀釋度孵育1 h，用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌3次。使用帶有HRP標記的山羊抗小鼠多克隆抗體(Abcam，UK)以1∶2 500稀釋度孵育1 h。用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌3次后，根據(jù)說明書用DAB試劑盒(Vector Laboratories)對切片染色，并用蘇木精復染。隨后，通過濃度遞增的乙醇和二甲苯脫水。用顯微鏡(日本Nikon H550S)拍攝電子圖像，并使用Image Pro Plus 6.0計算平均光密度，該平均光密度代表SBP-1的定量蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，通過配對Mann-WhitneyU檢驗分析兩組間SBP-1的表達水平差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SBP-1蛋白在組織中的表達水平分析 在先前的蛋白質(zhì)組學研究中，我們通過2-DE和MALDI-TOF-MS技術研究了18例LUAD及其癌旁組織，與癌旁組織相比，SBP-1蛋白在LUAD組織上調(diào)。為了驗證與癌旁組織相比SBP-1蛋白在LUAD中是否上調(diào)。我們對另一獨立的肺癌組織(包括LUAD和LUSC)和配對的癌旁組織樣本進行了免疫組織化學染色。通過免疫組織化學分析對36例肺癌樣本(0.017 2±0.017 7)和匹配癌旁組織(0.004 0±0.006 5)以及21例PTB樣本(0.005 3±0.007 6)進行SBP-1表達的定量分析。結果顯示SBP-1蛋白主要集中在肺癌組織的肺泡上皮細胞，并分布在細胞質(zhì)和細胞核中。與肺癌樣本相比，在癌旁組織中觀察到SBP-1在零星的細胞中表達，但是染色強度卻更高。盡管SBP-1蛋白主要在肺泡上皮細胞中表達，但它更集中于細胞核(圖1)。同樣的在LUAD中檢測到SBP-1表達上調(diào)也比較明顯(P<0.05)(圖1-C)。另外，SBP-1區(qū)分LUAD和癌旁組織的特異度高達95.7%(95%CI：0.76～0.97)，受試者操作特征(ROC)曲線下面積(AUC)為0.863 9(圖1-D)。LUSC和癌旁組織之間沒有顯著差異。痰涂片陽性PTB(P-PTB)和痰涂片陰性PTB(N-PTB)樣本之間也無明顯差異。此外，與P-PTB組(P<0.05)和N-PTB組(P<0.05)相比，肺癌組織中SBP-1表達上調(diào)。特別是在LUAD中，SBP-1對鑒別LUAD和PTB特異度高達93.3%(95%CI，0.79～1.0)，AUC為0.892 8(圖1-E)。

注：A：肺癌和肺結核組織SBP-1蛋白免疫組化染色(×200)，a為肺腺癌組織，b為肺鱗癌組織，c為癌旁組織，d為肺結核組織；B、C：SBP-1蛋白在肺癌、癌旁、肺結核組織中的表達水平分析；D、E：利用SBP-1從癌旁和肺結核組織中鑒別肺腺癌的ROC曲線，Para表示癌旁組織

2.2 SBP-1蛋白在組織中的定位 我們還在肺癌和癌旁組織細胞中定位了SBP-1蛋白，以檢測人體異常條件下細胞中SBP-1蛋白的分布。我們通過免疫熒光分析證實了SBP-1蛋白同時分布在細胞質(zhì)和細胞核中(圖2)。在肺癌樣本的細胞核中觀察到輕微的免疫熒光信號，可能是由于染色質(zhì)變松。在癌旁組織中，SBP-1蛋白分布在細胞質(zhì)和細胞核中，但更多地集中于細胞核。同樣，在肺結核樣本中也觀察到在細胞質(zhì)和細胞核中分布SBP-1蛋白，在細胞核中免疫熒光信號輕微。并且觀察到與肺癌樣品相比，PTB組織細胞核較小的現(xiàn)象。

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，具有最高的發(fā)病率和病死率。根據(jù)病理類型的不同，肺癌可分為SCLC和NSCLC。NSCLC是最常見的肺癌病理類型，占肺癌的85%，其5年生存率僅為15.9%[22]。目前，治療NSCLC的常用方法是手術，化學療法和免疫療法。手術治療對于處于不同階段的癌癥患者具有不同的治療效果。對于晚期NSCLC患者，主要通過手術切除進行治療，但腫瘤復發(fā)仍不可避免[23]。靶向腫瘤的小分子化療藥盡管對腫瘤表現(xiàn)出良好的殺傷作用，雖然能夠在一定程度上延長生存時間，但常常伴隨一系列不良反應。PD-1/PD-L1單克隆抗體是用于腫瘤免疫治療的一線藥物，即使是對PD-L1陽性的患者有效率也達不到100%。由于耐藥性的問題想要長期有效地抑制腫瘤的發(fā)展在很大程度上不可能的，因此需要盡可能在早期就進行醫(yī)療干預。因此發(fā)現(xiàn)一種能夠達到早期診斷目的的腫瘤標志物顯得非常重要。

SBP-1是一種高度保守的蛋白，分子量56 kD，人與小鼠之間的同源性為86%[24]。SBP-1在人的心、肝、脾、肺、腎、結直腸和前列腺中有不同程度表達。作為腫瘤抑制因子，SBP-1在許多腫瘤中表達，例如肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、食管鱗狀細胞癌和黑素瘤。Chen等[15]研究了94例LUAD組織和10例正常肺組織，發(fā)現(xiàn)SBP-1在LUAD中的表達水平與腫瘤的分化程度和TNM臨床分期有關，而低水平的SBP-1可以預測不良預后。此外，Tan 等[19]研究了82例LUSC，結果表明SBP-1在LUSC中的表達水平較正常支氣管組織降低，SBP-1表達水平與年齡、性別、原位腫瘤分期、TNM臨床分期和遠處轉(zhuǎn)移無相關性，與淋巴結轉(zhuǎn)移和低生存率顯著相關，低水平的SBP-1可作為LUSC不良預后的獨立影響因素。但是根據(jù)我們之前的蛋白組學研究，SBP-1蛋白在LUAD中表達上調(diào)，為了驗證這一結果我們做了進一步研究。

我們通過免疫熒光和免疫組織化學研究了SBP-1蛋白在NSCLC和PTB組織中的定位情況和表達水平。免疫熒光實驗結果表明，SBP-1蛋白在NSCLC和PTB組織的細胞質(zhì)和細胞核中表達。然而，在癌旁組織中SBP-1蛋白更集中于細胞核中。在前列腺癌研究中，腫瘤細胞中SBP-1蛋白的核質(zhì)比與腫瘤的惡性呈負相關[14]。因此，免疫熒光實驗結果表明，SBP-1蛋白在腫瘤細胞中的分布對判斷腫瘤的惡性程度有一定的指導作用，也表明SBP-1蛋白可能在腫瘤的發(fā)生中起關鍵作用。免疫組織化學結果表明，肺癌中SBP-1的表達明顯高于癌旁組織，而LUAD的表達明顯高于LSUC。這一發(fā)現(xiàn)有助于區(qū)分不同組織學類型的NSCLC。尤其在LUAD中，SBP-1的表達明顯高于PTB。另外，SBP-1鑒別LUAD和正常組織的特異度達到了95.7%，AUC為0.863 9，表明SBP-1蛋白具有從正常組織中鑒別肺腺癌的潛在價值。如果結合使用其他標志物，這將極大地提高LUAD的診斷效率。SBP-1蛋白有潛力作為評估LUAD發(fā)展和預后的指標，甚至可以作為LUAD的診斷標志物或療效評判指標。

本研究首次檢測到PTB組織中SBP-1蛋白的表達，研究表明SBP-1蛋白具有評估LUAD發(fā)展和預后的潛力，甚至可以作為LUAD的輔助診斷工具，具有良好的臨床應用價值。SBP-1蛋白的表達水平在一定程度上也有助于區(qū)分LUAD和LUSC。另外，SBP-1蛋白的核質(zhì)比在判斷肺癌的惡性程度方面也具有一定的指導作用。