鄭鍶雨 張?jiān)娾?邵 波

(浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院 環(huán)境工程專業(yè)，浙江 杭州 310000)

引言

當(dāng)前世界對(duì)于能源的消耗日益增長(zhǎng)，尤其是對(duì)石油的利用，開發(fā)過度不利于長(zhǎng)久發(fā)展[1]，同時(shí)，中國(guó)的環(huán)境破壞也日趨嚴(yán)重，廢水廢氣廢渣正從生活的方方面面影響著中國(guó)健康的環(huán)境[2]。因此，對(duì)于清潔可利用能源的開發(fā)就顯得日漸緊迫。在已知可用的清潔能源中，最具潛力的是生物柴油[3]，它是綠色環(huán)保發(fā)展的重要選項(xiàng)[4]。目前已知生物柴油的生產(chǎn)方法主要依靠動(dòng)植物，但這類方法原料成本較高[5]，因此我們需要尋找一些廉價(jià)、快捷又便于產(chǎn)業(yè)化的方式進(jìn)行生物柴油的開發(fā)研究，其中，采用產(chǎn)油微生物生產(chǎn)油脂具有高效、便捷和低成本等優(yōu)點(diǎn)，可以有效緩解此類問題。

以產(chǎn)油微生物為主要生產(chǎn)者開發(fā)微生物油脂可以在一定程度上降低生產(chǎn)成本[6]，它們能夠利用外界條件將有機(jī)碳源通過配合氮源和無機(jī)鹽輔助因子在體內(nèi)合成轉(zhuǎn)化后得到的甘油酯，這類甘油酯便是微生物油脂(microbial oils)。和常見的產(chǎn)油農(nóng)作物相比，產(chǎn)油微生物的生長(zhǎng)周期更快且所需能源較少，可以在更復(fù)雜的條件下生存，能適應(yīng)各種不同的生存環(huán)境且所得產(chǎn)物也更為清潔[7]。在能產(chǎn)生油脂的種類的微生物中研究對(duì)象常以酵母菌和霉菌居多[8]。同時(shí)，微生物產(chǎn)油通常需要一定的產(chǎn)油環(huán)境，產(chǎn)油環(huán)境是開采生物柴油的另一個(gè)重要因素，影響著最終產(chǎn)油成果，表現(xiàn)為產(chǎn)油微生物生長(zhǎng)的需要使用大量的培養(yǎng)基?？紤]到生物產(chǎn)油的工業(yè)化推廣性及經(jīng)濟(jì)效益性，對(duì)于培養(yǎng)基的選擇往往更需要我們尋找廣泛存在且廉價(jià)的物品作為產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)基底物，期望在節(jié)省成本的同時(shí)不損產(chǎn)油率，將實(shí)驗(yàn)效果最大化。

鑒于微生物油脂的研究背景、現(xiàn)有的微生物油脂開發(fā)技術(shù)以及限制條件[9，10]，本論文研究將采用生活中常見且難以轉(zhuǎn)化的蔗渣作為廉價(jià)碳源，以小球藻為產(chǎn)油微生物的研究案例，培養(yǎng)微藻吸收轉(zhuǎn)化蔗渣水解液中的糖類及纖維素，既能制備廉價(jià)碳源培養(yǎng)基，又能培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)微生物油脂[11]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甘蔗(網(wǎng)購(gòu) 海南?？?；氫氧化鈉(分析純，西隴科學(xué)有限公司)；濃鹽酸(分析純，杭州化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸(分析純，如皋市金陵試劑廠)；檸檬酸三鈉(分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；A50000μ/g酸性纖維素酶(河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司)；含量95.0-98.0%硫酸(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；正己烷(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；苯酚(分析純，華東醫(yī)藥股份有限公司)；無水乙醇(分析純，安徽安特食品股份有限公司)；尿素(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；HH-1恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠)；THZ82恒溫水浴振蕩器(國(guó)華企業(yè))；高溫滅菌鍋；PRX-350D智能人工氣候箱(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)；Universal 320高速離心機(jī)(Hettich 德國(guó))；分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蔗渣預(yù)處理及水解液的制備方法

蔗渣的預(yù)處理及水解液的制備方法根據(jù)文獻(xiàn)的方法[12，13]略有改進(jìn)，具體如下：

將廢棄蔗渣平鋪在托盤中，置于40℃烘箱中低溫過夜。用高速粉碎機(jī)將甘蔗渣粉碎成蔗渣粉。按蔗渣用量5%(w/v)的劑量加入1mol/L NaOH溶液，放置在室溫處理18小時(shí)。處理完畢后用抽濾機(jī)獲取蔗渣，將其放置在70℃烘箱中烘干至恒重。加入0.1mol/L HCL溶液后置于99℃恒溫水浴鍋加熱25分鐘。冷卻至室溫后再進(jìn)行抽濾，再將所得蔗渣置于70℃烘箱進(jìn)行烘干。在烘干蔗渣中按比例加入pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液，混勻，置于99°C恒溫水浴鍋加熱40分鐘。冷卻至室溫后，按0.66g/mL的劑量加入酸性纖維素酶，置于50℃恒溫水浴振蕩器以150r/min的轉(zhuǎn)速振蕩酶解48h。酶解后將溶液倒入50mL離心管中以8000r/min離心20分鐘，將液體倒入錐形瓶中。最后放置高溫滅菌進(jìn)行滅菌處理。

所得水解液中的糖份為原料殘存的蔗糖及水解纖維素后得到的糖類，兩種糖類在相同實(shí)驗(yàn)條件下均可被小球藻所利用，且不會(huì)對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)造成嚴(yán)重影響。

1.2.2 小球藻階段培養(yǎng)方法

本實(shí)驗(yàn)主要分為兩個(gè)階段進(jìn)行：

階段一 對(duì)不同水解液濃度的小球藻進(jìn)行異樣培養(yǎng)[14]，實(shí)驗(yàn)采用控制變量法，其中蔗渣水解液濃度為變量。

階段二 在階段一的基礎(chǔ)上，對(duì)不同培養(yǎng)因素影響下的水解液小球藻培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)采用正交法[15]，通過采用①碳氮比為變量(尿素含量取0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L)；②pH值為變量(pH范圍為5-7、pH范圍為7、pH范圍為7-9)[16]；③光照時(shí)長(zhǎng)(6h、12h、18h)為條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體分組見表3。

1.3 分析方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)線測(cè)水解液糖含量

參考文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)方案操作如下[17]：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取10支25mL的比色管，分別加入含50mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8ml，在上述比色管中分別加入6%的苯酚溶液1mL，濃硫酸溶液5mL，純水定容，繪制糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

水解液中糖分含量的測(cè)定：取1mL1.2.1中的蔗渣水解液，純水稀釋100倍后，取稀釋后的水解液1mL，加入1mL水，1mL6%的苯酚溶液，5mL濃硫酸溶液，純水定容，靜置10min，搖勻，放置30min，用分光光度計(jì)在490nm處進(jìn)行比色，測(cè)得水解液中總糖的含量(g/L)。

1.3.2 小球藻生長(zhǎng)及產(chǎn)油狀況分析

對(duì)于小球藻生長(zhǎng)及產(chǎn)油狀況的分析主要通過測(cè)定小球藻的生長(zhǎng)量以及產(chǎn)油量情況進(jìn)行分析。

生長(zhǎng)量的測(cè)定主要通過離心，破碎細(xì)胞壁；速凍，除去多余的水分，得到細(xì)胞干重。

油脂含量的測(cè)定主要通過加入有機(jī)試劑，放入高速離心機(jī)離心，使油脂充分溶于其中，再分餾得到溶有油脂的有機(jī)相。恒溫水浴蒸干有機(jī)相后，得到油脂重量。通過計(jì)算前后質(zhì)量變化得到小球藻產(chǎn)油率[18]。

2 結(jié)果分析

2.1 糖含量線性范圍

將50mg/L葡萄糖對(duì)照品混合液在490nm光照處進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得糖的峰面積與對(duì)應(yīng)濃度工作曲線進(jìn)行線性回歸，得到線性方程為：y=0.1886x+0.0106，相關(guān)系數(shù)r≥0.9990，線性關(guān)系良好。

2.2 不同水解液預(yù)處理方法對(duì)比測(cè)定糖含量

樣品分別?。孩儆?.2.1方法制備水解液樣品A，②前步驟與1.2.1相同但未經(jīng)高溫滅菌處理的水解液B[19]，實(shí)驗(yàn)測(cè)得稀釋100倍后的水解液A吸光值為：1.1566；水解液B吸光值為：0.9805，經(jīng)線性擬合后得水解液A中糖含量為30.71g/L；水解液B中糖含量為25.00g/L。

可見高溫滅菌處理能增大水解液中的糖含量，已知小球藻合成微生物油脂是通過對(duì)有機(jī)碳源的合成與利用，有利于小球藻自身油脂的累積，因此經(jīng)高溫滅菌處理后的水解液將更有利于小球藻油脂的合成[20]。

2.3 不同濃度水解液對(duì)小球藻產(chǎn)油的影響

本實(shí)驗(yàn)以小球藻對(duì)有機(jī)碳源的利用合成為生物油脂為目標(biāo)，通過分析對(duì)比不同濃度水解液培養(yǎng)下小球藻的生長(zhǎng)量、油脂產(chǎn)量獲取其產(chǎn)油率，結(jié)合三項(xiàng)指數(shù)[21]，獲取最適合小球藻合成油脂的水解液濃度。

其中實(shí)驗(yàn)主要分為兩個(gè)階段三個(gè)實(shí)驗(yàn)：

第一階段第一個(gè)實(shí)驗(yàn)：水解液梯度培養(yǎng)下小球藻生物量及產(chǎn)油情況分析(水解液濃度分別為：0.00g/L、0.60g/L、1.18g/L、1.74g/L、2.28g/L)獲取最適宜小球藻生長(zhǎng)的水解液濃度范圍。

第一階段第二個(gè)實(shí)驗(yàn)：由第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲得的最適宜水解液濃度范圍為基礎(chǔ)，進(jìn)行小球藻在縮小范圍后的水解液梯度培養(yǎng)。

第二階段第一個(gè)實(shí)驗(yàn)：在第一階段第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲得的最適宜水解液濃度范圍為基礎(chǔ)，通過其他條件(光照時(shí)長(zhǎng)、pH值、氮元素含量)的改變，進(jìn)行小球藻在等濃度水解液的不同生長(zhǎng)條件下的培養(yǎng)。綜合分析后最終得出最適宜小球藻生長(zhǎng)及產(chǎn)油的條件。

2.3.1 較大范圍水解液梯度培養(yǎng)下小球藻生物量及產(chǎn)油情況分析

實(shí)驗(yàn)通過控制變量法，在條件不變(培養(yǎng)基：75mL，藻液50mL，光照時(shí)長(zhǎng)：12h，pH值：7，尿素含量：50mmol/L)情況下，按水解液體積梯度培養(yǎng)小球藻。小球藻平均生長(zhǎng)量、平均油脂及產(chǎn)油率見表1。

表1 不同濃度水解液培養(yǎng)下小球藻的生長(zhǎng)及產(chǎn)油情況

水解液濃度與小球藻平均生長(zhǎng)量、油脂含量、產(chǎn)油率的關(guān)系曲線見圖1。

圖1 不同糖濃度(0-2.28g/L)培養(yǎng)下小球藻的生長(zhǎng)情況、油脂含量及產(chǎn)油率折線圖

由上述圖表可知，在水解液濃度為0.60-1.18g/L時(shí)，小球藻產(chǎn)油率最高。當(dāng)水解液濃度小于1.18g/L時(shí)，油脂產(chǎn)率隨水解液濃度上升而增大；當(dāng)濃度大于1.18g/L時(shí)，糖含量過高導(dǎo)致抑制小球藻的生長(zhǎng)以及內(nèi)部油脂積累。

2.3.2 縮小范圍水解液梯度培養(yǎng)下小球藻生物量及產(chǎn)油情況分析

在水解液體積為2.50-5.00mL即總糖含量為0.60-1.18g/L時(shí)，小球藻各項(xiàng)指標(biāo)最優(yōu)化，因此本實(shí)驗(yàn)將縮小濃度范圍，針對(duì)該范圍內(nèi)的水解液情況，在條件不變情況下，通過控制變量法，按梯度培養(yǎng)小球藻。小球藻平均生長(zhǎng)量、平均油脂及產(chǎn)油率見表2。

表2 縮小范圍后不同濃度水解液培養(yǎng)下小球藻的生長(zhǎng)及產(chǎn)油情況

縮小濃度范圍的水解液濃度與小球藻平均生長(zhǎng)量、油脂含量、產(chǎn)油率的關(guān)系曲線見圖2：

圖2 不同糖濃度(0-1.18g/L)培養(yǎng)下小球藻的生長(zhǎng)情況、油脂含量及產(chǎn)油率折線圖

由上述圖表可知，水解液濃度在0.72g/L時(shí)，小球藻產(chǎn)油率達(dá)到最大。當(dāng)水解液濃度小于0.72g/L時(shí)，小球藻生長(zhǎng)量、油脂含量及產(chǎn)油率成上升趨勢(shì)；當(dāng)濃度大于0.72g/L時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)及油脂累積呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明加入水解液過多將抑制小球藻的生長(zhǎng)，其產(chǎn)生原因可能是水解液中過多的糖分形成的不透明混合液會(huì)影響小球藻對(duì)光源的吸收。

2.4 不同生長(zhǎng)條件對(duì)小球藻產(chǎn)油的影響

由上一節(jié)實(shí)驗(yàn)可知，在水解液體積為3.00mL即總糖濃度為0.72g/L時(shí)，小球藻的各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最大化，基于此，本實(shí)驗(yàn)將在此濃度基礎(chǔ)上通過正交對(duì)比各種影響因素獲取最適小球藻生長(zhǎng)的條件。分組及其測(cè)定結(jié)果見表3，分析見表4：

表3 正交分析表

表4 各因素顯著性差異分析表

由表3、4可知，在三種對(duì)小球藻產(chǎn)油有影響的相關(guān)因素中，以pH對(duì)小球藻油脂產(chǎn)率的影響最大，其次為光照時(shí)長(zhǎng)，最后為尿素含量。可見，在pH為7時(shí)，小球藻產(chǎn)油率普遍較高，在此基礎(chǔ)上，光照時(shí)長(zhǎng)越長(zhǎng)，油脂產(chǎn)率越高，同時(shí)，尿素含量越高，產(chǎn)率越高。

三種因素中，當(dāng)pH在過低或過高情況下會(huì)出現(xiàn)抑制小球藻的生長(zhǎng)的情況。另外，光照時(shí)長(zhǎng)與小球藻的光合作用有密切的關(guān)系，由表可知光照時(shí)間越長(zhǎng)，小球藻生長(zhǎng)量越大，越有利于其合成油脂。最后，尿素中含有的氮元素作為小球藻生長(zhǎng)的必要條件之一，其含量也與小球藻的生長(zhǎng)及產(chǎn)油有關(guān)，由表中數(shù)據(jù)可知氮元素含量越高，小球藻產(chǎn)油量越大，反之，則越小。

因此，在其他條件不變情況下，當(dāng)尿素含量為100.0mmol/L，光照時(shí)長(zhǎng)為18h，pH為7時(shí)，小球藻產(chǎn)油率最高，為51.62%。

3 結(jié)論

通過對(duì)兩種處理方法得到的水解液糖含量對(duì)比得水解液A中糖含量為30.71g/L，可見高溫滅菌后的水解液含糖量更高，更有利于小球藻的利用和生長(zhǎng)；通過兩個(gè)階段的水解液梯度培養(yǎng)下小球藻生物量及產(chǎn)油情況分析得到，水解液為3.00mL即總糖濃度為0.72g/L時(shí)產(chǎn)油率最高；基于此，在水解液為3.00mL時(shí)，通過正交實(shí)驗(yàn)測(cè)定各生長(zhǎng)條件對(duì)小球藻產(chǎn)油的影響，得到在pH對(duì)小球藻影響最大，當(dāng)在pH為7.0，光照時(shí)長(zhǎng)為18.0h，氮含量100.0mmol/L時(shí)小球藻產(chǎn)油率達(dá)到最大，為51.62%。

4 展望

當(dāng)前全世界對(duì)化石燃料的使用不但會(huì)耗盡有限資源，而且會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的破壞。生物柴油作為一種清潔能源，可以減小對(duì)環(huán)境的破壞，并且可以重復(fù)利用一些被浪費(fèi)的能源，譬如廢棄的蔗渣。而微生物油脂的誕生給又給生物柴油的發(fā)展指明了新的方向，也為清潔能源的開發(fā)提供了新的可選資源[22，23]。微生物產(chǎn)油比其他產(chǎn)油作物而言，其產(chǎn)油更為方便快捷、廉價(jià)且更容易適應(yīng)環(huán)境[24]。就其應(yīng)用方向而言，它更能作為日漸流行的綠色發(fā)展趨勢(shì)，也將更加有利于環(huán)保事業(yè)與綠色資源的發(fā)展。

微生物油脂的生產(chǎn)者常常以酵母或霉菌為主[25]。除此之外，雖然目前研究較多還有藻類，但產(chǎn)油微生物即產(chǎn)油微藻是一種常常因其分布較多而被人忽視其優(yōu)良的產(chǎn)油性能的生物[26]。在當(dāng)前已有的研究中，對(duì)產(chǎn)油酵母的研究主要是粘紅酵母，而對(duì)產(chǎn)油微藻的研究則以小球藻為主。

相比較國(guó)外而言，我國(guó)雖起步較晚，卻有十分豐富的原料資源[27]，而且中國(guó)對(duì)于油脂的需求日漸增大。而在已知的廉價(jià)碳源主要包括有：甘油、有機(jī)廢水、木質(zhì)纖維素水解液等[28]。而蔗渣是一種常見且廉價(jià)的固體廢渣原料產(chǎn)量巨大[29]，不僅對(duì)環(huán)境有一定的污染性，同時(shí)由于蔗渣質(zhì)地粗硬，含有的蛋白質(zhì)較少等特點(diǎn)而難以處理，在生產(chǎn)過程中很難作為動(dòng)植物的飼料被回收利用，更多是處于廢棄的狀態(tài)，而浪費(fèi)了其含有的大量纖維素和糖分[30，31]。本研究通過對(duì)生活中常見廢棄蔗渣的研究，重新利用其中富含的碳水化合物[32]，基于廢蔗渣為原料培養(yǎng)小球藻產(chǎn)油方法便捷，成本低廉，具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景，為固廢回收利用及微藻產(chǎn)油經(jīng)濟(jì)化提供了參考。