李澤宇,高 利,車(chē)方怡,劉水永恒,灑榮波,張顯忠,史仁玖

(山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安 271016)

L-蘇氨酸(L-Threonine,Thr),分子式C4H9NO3,相對(duì)分子量119.12,白色結(jié)晶或結(jié)晶粉末,是人體的必需氨基酸之一[1-2]。L-蘇氨酸作為八種必需氨基酸之一,廣泛地應(yīng)用在食品[3-4]、飼料[5]、醫(yī)藥[6]、化妝品[3]和保健品[7-9]等多個(gè)領(lǐng)域。L-蘇氨酸的生產(chǎn)方法主要有發(fā)酵法、蛋白質(zhì)水解法和化學(xué)合成法3種。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蘇氨酸,因其工藝簡(jiǎn)單,成本低廉等優(yōu)點(diǎn)已成為目前主流方法[10]。

目前,L-蘇氨酸的測(cè)定方法主要有氨基酸分析儀法、紙層析法[11-13]、薄層層析法[14-15]、高效液相法[16-18]、荷移比色法[19]等。這些方法分析的原理,分析所需時(shí)間、成本、精確度及優(yōu)缺點(diǎn)都有所不同。氨基酸分析儀法檢測(cè)效果最好,可分離的氨基酸種類(lèi)最多,通常作為氨基酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。然而氨基酸分析儀只能用來(lái)檢測(cè)氨基酸,且使用的試劑和色譜柱價(jià)格昂貴,普通實(shí)驗(yàn)室不易擁有。紙層析法分離種類(lèi)較少的氨基酸效果較好,成本低,一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行,但在分離多種氨基酸和極性相近的氨基酸效果較差。薄層層析法同紙層析法類(lèi)似,適合分離種類(lèi)較少的氨基酸,成本低,在分離多種氨基酸和極性相近的氨基酸效果較差[11],與紙層析法相互補(bǔ)可以低成本分離部分常用氨基酸。高效液相法檢測(cè)效果好,雖檢測(cè)精度和可分離的氨基酸種類(lèi)不及與氨基酸分析儀但已滿(mǎn)足絕大部分精密實(shí)驗(yàn)的需求。價(jià)格相對(duì)于氨基酸分析儀低很多,并可以測(cè)量其他種類(lèi)的物質(zhì),一機(jī)多用。缺點(diǎn)是衍生試劑對(duì)人體有害,需要注意操作,色譜柱壽命較短,需要經(jīng)常更換色譜柱。荷移比色法分離效果較好[19],但該方法報(bào)道的文獻(xiàn)與研究較少,優(yōu)缺點(diǎn)與層析法類(lèi)似,故本實(shí)驗(yàn)未選取。

針對(duì)以上方法的優(yōu)缺點(diǎn),本研究選擇了紙層析法、薄層層析法、高效液相PITC柱前衍生法進(jìn)行研究比較。以上三種方法廣泛應(yīng)用并具有明確的代表性。紙層析法和薄層層析法成本低廉,對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求低,一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行,非常適合菌種的初步選育。高效液相法精確快速,成本相對(duì)于氨基酸分析儀較低,且高校液相色譜儀用途多樣,可用于測(cè)定分析多種物質(zhì)。本文選取的層析濾紙、薄層層析板均為國(guó)產(chǎn),價(jià)格較低。本文的高效液相法選擇了PITC(異硫氰酸苯酯)柱前衍生法,PITC法相對(duì)于其他柱前衍生法樣品保存時(shí)間長(zhǎng),價(jià)格較低,可使用氨基酸分析柱或普通C18柱測(cè)定,色譜柱也選擇了價(jià)格較為便宜的色譜柱。在以往的研究中,將方法數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比的較少。本研究將這三種有代表性的檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)的評(píng)價(jià),通過(guò)對(duì)10份發(fā)酵液進(jìn)行L-蘇氨酸含量檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析,歸納對(duì)比了不同方法之間的相關(guān)性、應(yīng)用特點(diǎn)和不足,為L(zhǎng)-蘇氨酸含量的定性和定量分析以及拓展延伸至其它氨基酸提供技術(shù)信息和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同的氨基酸發(fā)酵液10份 實(shí)驗(yàn)室自制(某基因工程菌株E.coli,中藥生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存);PITC、三乙胺、無(wú)水乙酸鈉、水合茚三酮和L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 索萊寶科技有限公司;正己烷、甲醇、乙腈和丙酮 天津永大有限公司;硫酸銅、正丁醇、冰乙酸和乙醇 天津凱通化學(xué)試劑有限公司;硅膠層析板 煙臺(tái)江友有限公司;新華三號(hào)層析濾紙 廣州紫宸化玻儀器;除甲醇乙腈為色譜純外，其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司,由G1311B高壓四元梯度泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測(cè)器及安捷倫色譜工作站組成;SMA色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm) 天津普祥科技有限公司;V1100D紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液樣品的制備 取100 μL 1.1中所述菌株的甘油管保存液接入100 mL LB培養(yǎng)基,培養(yǎng)至OD值0.6～0.8,以6%接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。蔗糖含量分別為30和45 g/L,其他成分為硫酸銨10 g/L,碳酸鈣35 g/L,磷酸二氫鉀2 g/L,硫酸鎂2 g/L,卡那霉素50 mg/L,甜菜堿1.5 g/L,一水硫酸錳20 mg/L,七水硫酸亞鐵20 mg/L。110 ℃,10 min滅菌,初始pH6.8～7.0,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)。以添加30 g/L蔗糖培養(yǎng)30、34、38、42和46 h作為樣品4、5、2、3和1。以添加45 g/L蔗糖培養(yǎng)48、52、56、60和64 h作為樣品6、7、10、8和9。

1.2.2 高效液相法(PITC柱前衍生)

1.2.2.1 溶液配制 PITC乙腈溶液(0.1 mol/L):取0.3 mL PITC置于25 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,4 ℃保存。三乙胺乙腈溶液(0.1 mol/L)取1.3 mL三乙胺置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,4 ℃保存。

流動(dòng)相A:80%乙腈溶液(800 mL乙腈加200 mL超純水),超聲脫氣。流動(dòng)相B:97∶3 (V/V)乙酸鈉乙腈溶液(15.2 g無(wú)水乙酸鈉加超純水1850 mL溶解,冰醋酸調(diào)pH至6.5,加乙腈140 mL),超聲脫氣。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液:精確稱(chēng)取1.0 mg L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,加0.1 mol/L鹽酸溶解并定容至2 mL,配制成50 g/L L-蘇氨酸母液。通過(guò)逐級(jí)稀釋,配制為0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/L的系列溶液。

1.2.2.2 樣品配制 取1 mL發(fā)酵液,12000 r/min離心2 min,用超純水稀釋50倍,備用。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品樣品衍生處理 取L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,稀釋后的發(fā)酵液各200 μL,加入PITC乙腈溶液,三乙胺乙腈溶液各100 μL,混勻,室溫放置1 h,加入正己烷400 μL,充分振搖混勻,放置15 min,取下層溶液(不要吸入上層正己烷溶液),重復(fù)2次,12000 r/min離心5 min,0.45 μm濾膜過(guò)濾。

1.2.2.4 色譜條件 流動(dòng)相:A為乙酸鈉乙腈93∶7 (V/V)溶液,流動(dòng)相B為80%乙腈;梯度洗脫程序如表1;流速:1 mL/min;柱溫度:40 ℃;二極管陣列檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:5 μL[17-18]。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/L衍生處理后的L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述HPLC色譜條件進(jìn)行分析,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度X(g/L)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.6 含量計(jì)算 每樣品重復(fù)5次取平均值,以樣品分析的色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度(g/L),乘以稀釋倍數(shù)即為含量(g/L)。

1.2.3 紙層析法

1.2.3.1 溶液配制 顯色液:0.5%茚三酮溶液(0.5 g茚三酮用正丁醇定容至100 mL充分溶解)。展開(kāi)層析顯色液:正丁醇∶顯色液∶冰乙酸∶水=10∶2∶3∶5 (V/V)。洗脫液:0.1% CuSO4∶75%乙醇=2∶38 (V/V)。

表2 L-蘇氨酸不同含量測(cè)定方法間的比較Table 2 Comparison of different methods for determination of L-threonine

標(biāo)準(zhǔn)品配制:精確稱(chēng)取1.0 mg L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,加超純水溶解并定容至2 mL,配制成50 g/L L-蘇氨酸母液,通過(guò)逐級(jí)稀釋,配制為1、2、3、4、5 g/L的系列溶液。

樣品配制:取1 mL發(fā)酵液,12000 r/min離心2 min,用超純水稀釋10倍,備用。

1.2.3.2 分析方法 將新華3號(hào)層析濾紙裁剪至長(zhǎng)20 cm,寬10 cm。距離底端2 cm用鉛筆劃一條線,在線上間隔2 cm使用微量移液槍點(diǎn)樣,每次2.5 μL,點(diǎn)樣后使用吹風(fēng)機(jī)吹干,連續(xù)點(diǎn)樣2次。加入約20 mL展開(kāi)層析液,于層析缸內(nèi)平衡1 h后放下濾紙,使用大頭針固定于層析缸。層析1.5 h,放入烘箱105 ℃干燥顯色10 min,剪下顯色斑點(diǎn)(每個(gè)樣品剪下的面積要相同)。每個(gè)顯色斑點(diǎn)分別置于獨(dú)立試管中,加洗脫液6 mL,超聲40 ℃洗脫30 min,立即使用分光光度計(jì)檢測(cè)510 nm下吸光度。每個(gè)樣品(標(biāo)準(zhǔn)品)重復(fù)5次[12,15]。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將1、2、3、4、5 g/L的L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述方法進(jìn)行分析,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度X(g/L)為橫坐標(biāo),吸光度Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.4 L-蘇氨酸含量計(jì)算 每個(gè)樣品數(shù)據(jù)取平均值。以樣品分析的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度(g/L),乘以稀釋倍數(shù)即為含量(g/L)。

1.2.4 薄層層析法

1.2.4.1 溶液配制 同紙層析法。

1.2.4.2 分析方法 將薄層層析板切割至長(zhǎng)16 cm,寬10 cm。距離底端2 cm用鉛筆劃一條線,在線上間隔2 cm使用微量移液槍點(diǎn)樣,每次2.5 μL,點(diǎn)樣后使用吹風(fēng)機(jī)吹干,連續(xù)點(diǎn)樣2次。于層析缸內(nèi)層析1.5 h后放入烘箱105 ℃干燥顯色10 min,刮下顯色斑點(diǎn)(每個(gè)樣品刮下的顯色粉末要大致相同)。每個(gè)樣品的顯色粉末分別加入獨(dú)立試管中,加洗脫液6 mL,40 ℃振動(dòng)洗脫30 min,靜置2 min,立即使用分光光度計(jì)檢測(cè)510 nm下吸光度。每個(gè)樣品(標(biāo)準(zhǔn)品)重復(fù)5次[14-15]。

1.2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 同紙層析法。

1.2.4.4 含量計(jì)算 同紙層析法。

1.2.5 方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 紙層析法條件穩(wěn)定性 將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色斑點(diǎn)顯色后置于40 ℃培養(yǎng)箱0～60 min,按照1.2.3后續(xù)步驟測(cè)定不同放置時(shí)間的吸光度。將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色斑點(diǎn)顯色后置于40 ℃培養(yǎng)箱30 min,按照1.2.3后續(xù)步驟測(cè)定505～515 nm波長(zhǎng)的吸光度。

1.2.5.2 薄層層析法條件穩(wěn)定性 將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色斑點(diǎn)顯色后置于40 ℃培養(yǎng)箱0～60 min,按照1.2.3后續(xù)步驟測(cè)定不同放置時(shí)間的吸光度。將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色斑點(diǎn)顯色后置于40 ℃培養(yǎng)箱30 min,按照1.2.4后續(xù)步驟測(cè)定505～515 nm波長(zhǎng)的吸光度。

1.2.5.3 液相PITC衍生法條件穩(wěn)定性 將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸衍生后的標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃下放置0～7 d,測(cè)定其峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel等專(zhuān)業(yè)軟件來(lái)處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種分析方法的比較

2.1.1 回歸方程與線性相關(guān)系數(shù) 采用3種L-蘇氨酸定量方法,配制L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,根據(jù)測(cè)定結(jié)果制成各方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程見(jiàn)表2。由表2可知,幾種方法在有效范圍內(nèi)L-蘇氨酸響應(yīng)值(Y)與樣品的質(zhì)量濃度(X)間有良好的線性關(guān)系,其中紙層析法和薄層層析法的決定系數(shù)在0.99以上,液相PITC柱前衍生法的決定系數(shù)在0.999以上。標(biāo)準(zhǔn)品、樣品紙層析、薄層層析、液相PITC三種方法測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)圖1～圖6。

圖1 紙層析法標(biāo)準(zhǔn)品層析圖Fig.1 The standard productchromatogram of paper chromatography注:1～5分別為5、4、3、2、1 g/L L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品;圖2同。

圖2 薄層層析法標(biāo)準(zhǔn)品層析圖Fig.2 The standard product chromatogram of TLC

圖3 PITC法標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 The standard product chromatogram of PITC method

圖4 紙層析法樣品層析圖Fig.4 The sample productchromatogram of paper chromatography注:1～5分別為樣品1～5;圖5同。

圖5 薄層層析法樣品圖Fig.5 The sample product chromatogram of TLC

圖6 PITC法測(cè)定樣品的色譜圖Fig.6 The sample product chromatogram of PITC method

2.1.2 靈敏度 由表2可知,液相PITC柱前衍生法的檢出限最低,為1.2 μg/L,紙層析法其次,為5 μg/L,薄層層析法最高,為7 μg/L。因此,在靈敏度方面,液相PITC柱前衍生法>紙層析法>薄層層析法。

2.1.3 精密度 1 g/L標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測(cè)定(n=5),考察方法的精密度,由表2中的結(jié)果可見(jiàn)，液相PITC衍生法的精密度最高,為0.3%。紙層析和薄層層析法的精密度相近,分別為4.1%和3.4%。

2.2 各方法條件穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 紙層析法和薄層層析法條件穩(wěn)定性?xún)?yōu)化結(jié)果 結(jié)果如圖7、圖8和表3。由表3可知,在不同波長(zhǎng)條件下,紙層析法的P>0.05,無(wú)顯著性差異,薄層層析法0.010.05,無(wú)顯著性差異,薄層層析法P>0.05,無(wú)顯著性差異。結(jié)合圖、表結(jié)果,在實(shí)際操作中兩種方法應(yīng)選取510 nm,30 min測(cè)定條件為佳。

圖7 1 g/L L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在不同波長(zhǎng)下的吸光度Fig.7 Absorbance of 1 g/L L-threoninestandard at different wavelengths

圖8 1 g/L L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在不同放置時(shí)間下的吸光度Fig.8 Absorbance of 1 g/L L-threoninestandard at different placement times

2.2.2 液相PITC衍生法條件穩(wěn)定性?xún)?yōu)化 結(jié)果如圖9和表4。在圖9中可以看出,在3 d之后峰面積下降明顯加快。由表4可知0～3 d的P>0.05,無(wú)顯著性差異;4～7 d的P<0.01,有極顯著性差異。因此在衍生之后應(yīng)在3 d之內(nèi)測(cè)定結(jié)果較好。

表3 紙層析法和薄層層析法條件穩(wěn)定性?xún)?yōu)化結(jié)果Table 3 Optimization results of paper chromatography and thin layer chromatography for conditional stability

圖9 1 g/L衍生后L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同放置天數(shù)下的峰面積Fig.9 Peak area of L-threonine standard solutionafter 1 g/L derivatization under different days of placement

表4 液相PITC衍生法條件穩(wěn)定性?xún)?yōu)化結(jié)果Table 4 Optimization results of PITC derivative methodfor liquid phase conditional stability

2.2.3 不同方法測(cè)定10份樣品的L-蘇氨酸含量的結(jié)果及分析 不同方法測(cè)定10份樣品的結(jié)果見(jiàn)表5。由表6可知,在每組數(shù)據(jù)的方差分析中,紙層析和薄層層析法方差較大,PITC法方差較小,說(shuō)明PITC法的精確度最高,紙層析法和薄層層析法的精度次之。

2.3 不同方法的樣品加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱(chēng)取質(zhì)量為0.2、0.6、1.2 g的L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,加入到前面檢測(cè)含量最低和最高的兩組樣品(第4組和第9組樣品)中,測(cè)定三種方法的平均回收率,如表7所示,測(cè)得三種方法的平均回收率分別為95.60%、95.10%和99.30%。

表5 3種L-蘇氨酸測(cè)定方法對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果(n=5)Table 5 Test results of three L-threonine determination methods on actual samples(n=5)

續(xù)表

表6 L-蘇氨酸含量測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of L-threonine

表7 不同方法的樣品加標(biāo)回收率Table 7 Recovery rate of spiked samples by different methods

3 結(jié)論與討論

氨基酸檢測(cè)的方法多種多樣,不同的方法的精度、成本、時(shí)間都有所區(qū)別。根據(jù)不同的檢測(cè)需求與實(shí)驗(yàn)室條件,可選擇不同的檢測(cè)方法。在所選擇的三種方法中,紙層析法成本最低,一般的實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行,本實(shí)驗(yàn)所使用的層析濾紙也選擇了成本較低的國(guó)產(chǎn)濾紙。紙層析法在測(cè)定純度好的L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),線性、RSD和回收率均排在第三位,在測(cè)定混合樣品時(shí)回收率排在第二位,說(shuō)明紙層析法在成分較為復(fù)雜的樣品時(shí)優(yōu)于薄層層析法。在紙層析法實(shí)驗(yàn)中,將顯色劑與展開(kāi)劑合一,這樣做不僅減少了顯色后的花板現(xiàn)象,便于觀察結(jié)果,也減少了誤差和層析時(shí)間。展開(kāi)劑和層析液合一后的層析時(shí)間可以縮短為90 min,節(jié)省了操作時(shí)間,同時(shí)展開(kāi)劑和層析液合一也大大方便了操作。在層析液選取方面,比較了不同層析比例,最終選取了實(shí)驗(yàn)所用比例。在條件優(yōu)化方面,選定了510 nm顯色波長(zhǎng)和盡快測(cè)定。該方法的優(yōu)點(diǎn)是成本和對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求低。缺點(diǎn)是分離氨基酸種類(lèi)多或者極性相近的氨基酸混合溶液的效果不好。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,嘗試使用該方法分離多種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,效果較差。并結(jié)合部分文獻(xiàn)分離容易分開(kāi)的氨基酸種類(lèi)的混合溶液,雖取得了一定成功,但分離度較差,各氨基酸均有拖尾[20-21]。因此,在使用紙層析法時(shí),對(duì)于不同組分的混合溶液,應(yīng)選取不同的展開(kāi)劑和條件。

薄層層析法相比于紙層析法,在檢測(cè)純度好的L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),線性、RSD和回收率均好于紙層析法。然而在測(cè)定混合樣品時(shí),發(fā)現(xiàn)其不如紙層析法,原因可能與硅膠的吸附有關(guān),且本實(shí)驗(yàn)所使用的層析板為成本較低的國(guó)產(chǎn)層析板。在日后的實(shí)驗(yàn)中,考慮采用較好的薄層板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同理,紙層析法也可采用高質(zhì)量的層析紙進(jìn)行?？紤]到好的薄層板和層析紙價(jià)格較貴,不符合低成本測(cè)定L-蘇氨酸含量的特點(diǎn),故本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行比較。在薄層層析法實(shí)驗(yàn)中,也將顯色劑和展開(kāi)劑合一,取得了和紙層析法優(yōu)化后相近效果。在層析液選取方面,比較了不同的層析比例,發(fā)現(xiàn)紙層析法所用比例和水∶乙醇∶冰醋酸1∶6∶0.5 (V/V/V)[14]效果接近,為了實(shí)驗(yàn)和后續(xù)優(yōu)化條件的方便,故選取同紙層析法一樣的層析液。在條件優(yōu)化方面,顯色波長(zhǎng)和檢測(cè)時(shí)間與紙層析法接近,故選取510 nm和盡快測(cè)定。該方法在洗脫后需要靜置一定時(shí)間,以便部分由于震蕩浮起的硅膠粉末沉降。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是成本低和對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求低,與紙層析法互補(bǔ)可低成本檢測(cè)很多氨基酸。缺點(diǎn)和紙層析法類(lèi)似,分離氨基酸種類(lèi)多或者極性相近的氨基酸混合溶液的效果不好。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中同樣嘗試使用該方法分離多種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及結(jié)合文獻(xiàn)分離部分容易分開(kāi)的氨基酸種類(lèi)的混合溶液,結(jié)果與紙層析法相似,但容易分開(kāi)的氨基酸種類(lèi)不相同[22]。因此,紙層析法和薄層層析法可以互補(bǔ)來(lái)低成本測(cè)定部分種類(lèi)的氨基酸混合溶液。目前,一些研究者使用納米顯色劑來(lái)對(duì)薄層層析法進(jìn)行進(jìn)行快速薄層直讀顯色分析[23],這種方法相比于傳統(tǒng)方法快速高效,值得在以后的實(shí)驗(yàn)中深入研究。

高效液相PITC衍生法相比于其他兩種方法最精確,當(dāng)然成本也最高,不過(guò)相比于功能單一的氨基酸測(cè)定儀,高效液相色譜儀可以一機(jī)多用。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,也進(jìn)行了其他衍生方法的實(shí)驗(yàn)[24-27],考慮到成本和樣品保存,最終選擇了PITC作為衍生劑。在色譜條件方面,參考了色譜柱自帶說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn),比對(duì)了不同的條件,最終選擇了該色譜方法。在實(shí)際操作中,應(yīng)根據(jù)自身色譜柱選擇合適的分析方法。使用的色譜柱雖然是氨基酸分析柱,但價(jià)格較低,約3000元左右,該價(jià)格與普通C18色譜柱相當(dāng)。該方法優(yōu)點(diǎn)是所用的試劑相比于其他衍生試劑,保存時(shí)間長(zhǎng),價(jià)格較低,在分離多種按氨基酸混合溶液時(shí)分離度較好。缺點(diǎn)是該方法不能用于在線衍生,以及殘留在分析柱中的痕量衍生劑會(huì)縮短分析柱壽命[24]。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,使用該方法分離氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,效果較好。但在參考其他分離方法的基礎(chǔ)上[28-30],分離種類(lèi)很多的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)效果遠(yuǎn)不如氨基酸分析儀。因此,在分離種類(lèi)很多,一般大于17種常用氨基酸種類(lèi)的混合溶液時(shí),建議使用氨基酸分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

在誤差減少方面,紙層析法和薄層層析法后期采用了去掉極值取平均值的方法來(lái)減少誤差,同時(shí),在這兩種實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中,應(yīng)注意以下幾點(diǎn),可有效減少誤差:操作過(guò)程中全程戴干凈手套;所有實(shí)驗(yàn)接觸品都應(yīng)用超純水水清洗干凈(水可有效溶解L-蘇氨酸及大部分其他氨基酸);點(diǎn)樣尺寸不宜過(guò)大;層析液現(xiàn)用現(xiàn)配;每次測(cè)定完的儀器都應(yīng)充分沖洗;薄層層析板和層析濾紙要保持干凈,鑒于目前很多運(yùn)輸過(guò)程中的污染,建議使用中間的幾張或幾層層析板;操作過(guò)程要迅速等。在高效液相PITC柱前衍生法中,所有消耗品應(yīng)一次性使用,包括進(jìn)樣瓶、進(jìn)樣瓶蓋(包括瓶墊)、內(nèi)插管,一次性注射器等,每次進(jìn)樣完畢后使用乙腈進(jìn)行洗針,洗針瓶一次性使用等。雖然PITC柱子前衍生法的衍生溶液很穩(wěn)定,但在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,作者發(fā)現(xiàn)也會(huì)發(fā)生微小變化,因此在衍生后應(yīng)盡快測(cè)定,以減少誤差。

綜上所述,紙層析法和薄層層析法成本低,適合部分對(duì)精確度要求不高的含量測(cè)定。高效液相PITC柱前衍生法測(cè)定精確,成本較高,速度快,適合精確測(cè)定。然而,目前市場(chǎng)上仍缺乏一種快速又十分精確且價(jià)格低廉的L-蘇氨酸檢測(cè)方法,是本研究領(lǐng)域需要繼續(xù)解決的課題。