(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

靈芝生物活性成分復(fù)雜,現(xiàn)已從靈芝子實(shí)體、菌絲體和孢子中分離出279種具有藥理作用的活性物質(zhì),其中主要為多糖、三萜、多肽蛋白、生物堿、核苷等[1-2]。靈芝作為一種廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床的藥物,具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖血脂、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)神經(jīng)等藥理作用[4-10]。靈芝子實(shí)體栽培周期長,易受環(huán)境、季節(jié)等因素影響,現(xiàn)較多采用發(fā)酵的方式獲得靈芝菌絲體,發(fā)酵周期更短,過程易控制,更符合工業(yè)化生產(chǎn)需求[11-12]。目前對(duì)于靈芝發(fā)酵的研究報(bào)道多關(guān)注于對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化,或?qū)Πl(fā)酵產(chǎn)物的提取純化及結(jié)構(gòu)功能等方面,而對(duì)發(fā)酵的過程研究較少[13-16]。

米糠、麩皮是水稻和小麥的加工副產(chǎn)物,米糠、麩皮在我國有著廣泛的來源,目前這種低廉原料多被用作飼料、發(fā)酵輔料或從中提取有利成分,其綜合利用率不足20%[17,23]。Souza等[24]在餅干配方中加入不同比例的米糠,得到纖維、γ-谷維素和葉黃素含量均更高的米糠餅干。Feng等[25]用土曲霉CICC40205突變體生物轉(zhuǎn)化麥麩,生產(chǎn)衣康酸。

靈芝作為一種白腐真菌,能產(chǎn)生多種木質(zhì)纖維素降解酶,將復(fù)雜的木質(zhì)纖維素底物降解為簡單的糖,并作為生物燃料加以利用[26]。本研究以一株誘變得到的發(fā)酵性能較優(yōu)的靈芝菌株為研究對(duì)象,利用生物降解將米糠、麩皮用于生產(chǎn)價(jià)值更高的靈芝原料,并通過構(gòu)建液態(tài)發(fā)酵過程中靈芝菌體生長動(dòng)力學(xué)模型[27],深入了解靈芝液態(tài)發(fā)酵過程中菌體生長規(guī)律,為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。將復(fù)雜的木質(zhì)纖維素底物降解為簡單的糖,以產(chǎn)生未來的生物燃料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18 本課題組紫外誘變所得(保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)CCTCC NO:M 2018908);馬鈴薯 市售;米糠 粉碎后60目過篩,購于鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)三山米廠;麩皮 粉碎后60目過篩,購于鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)面粉加工廠;蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、瓊脂、葡萄糖、濃硫酸、苯酚等 均為分析純,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HVE-50高壓滅菌 上海賽默生物科技有限公司;SF-CJ-2AG凈化工作臺(tái) 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;HSX-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海海向儀器設(shè)備廠;HYL-C組合式搖床 太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;721G可見分光光度計(jì) 上海恒勤儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝發(fā)酵培養(yǎng)方法 在超凈工作臺(tái)中,從保藏的靈芝菌株固體斜面上,切割一個(gè)邊長為0.4 cm的正方形菌塊,將其轉(zhuǎn)接到準(zhǔn)備好的PDA[14]平板上,28 ℃培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)完成后,從平板上切割10個(gè)菌塊轉(zhuǎn)接至PD液體培養(yǎng)基中,120 r/min、28 ℃培養(yǎng)6 d可得種子液。再將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中(按各因素水平參數(shù)設(shè)置進(jìn)行配制),接種量10%,120 r/min、28 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2.2 菌絲干重測(cè)定方法 發(fā)酵完成后,發(fā)酵液經(jīng)60目網(wǎng)篩過濾,濾出物于50 ℃烘干至恒重稱重得到菌絲干重。

1.2.3 靈芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體生長經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型方程的研究 以培養(yǎng)基中米糠、麩皮、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂添加量和發(fā)酵時(shí)間為因素進(jìn)行均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì),同時(shí)將米糠和麩皮總量限定為10 g(每100 mL培養(yǎng)基中用量,下同),即將米糠和麩皮作為一個(gè)因素。以菌絲干重作為評(píng)價(jià)指標(biāo),利用SPSS線性回歸得到靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液態(tài)發(fā)酵菌體生長經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型方程。根據(jù)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)次數(shù)須大于15,考慮到時(shí)間安排的合理性,采用U24(244)均勻設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。各因素范圍:米糠0.4～9.6 g、磷酸二氫鉀0.015～0.36 g、七水硫酸鎂0.015～0.36 g、時(shí)間0.5～12 d,共24個(gè)水平。

1.2.4 靈芝液態(tài)發(fā)酵菌體生長理論動(dòng)力學(xué)模型方程的研究 Logistic模型曲線呈S型,能較好地反映微生物生長隨時(shí)間的變化規(guī)律,具有一定的適用性[17]。Logistic方程為:

式(1)

式中:Cx,0為初始菌絲體濃度,測(cè)得為0.208 g/100 mL;Cx,max為最大菌絲濃度,單位g/100 mL;μm為最大比生長速率,單位d-1;t為時(shí)間,單位d。

本研究所得的靈芝菌體生長經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)方程是關(guān)于培養(yǎng)基各成分及發(fā)酵時(shí)間的函數(shù)方程,利用Excel對(duì)此方程進(jìn)行計(jì)算可得到特定培養(yǎng)基條件下,菌絲干重隨時(shí)間變化的預(yù)測(cè)值。培養(yǎng)基條件設(shè)置采用U16(163)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì),各因素范圍:米糠0.6～9.6 g、磷酸二氫鉀0.02～0.32 g、七水硫酸鎂0.02～0.32 g,時(shí)間設(shè)置為1～12 d。用SPSS非線性回歸代入Logistc方程得到對(duì)應(yīng)條件下參數(shù)μm和Cx,max的值,再進(jìn)行線性回歸即可得到參數(shù)μm和Cx,max關(guān)于培養(yǎng)基各成分的表達(dá)式,將其代入Logistic方程即可得靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液態(tài)發(fā)酵菌體生長理論動(dòng)力學(xué)模型方程。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三個(gè)平行樣品的平均值,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。本研究中采用的均勻設(shè)計(jì)表均來自聯(lián)合國際學(xué)院https://uic.edu.hk//～isci/Uniform Design/table/Un_n%5es.html。

2 結(jié)果與分析

2.1 U24(244)均勻試驗(yàn)結(jié)果

按表1實(shí)施U24(244)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì),發(fā)酵完成后測(cè)得菌絲干重結(jié)果如下:

表1 U24(244)均勻試驗(yàn)參數(shù)控制表及試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Parameters control table andresults of uniform design U24(244)

在表1中菌絲干重是在不同米糠用量、磷酸二氫鉀用量、七水硫酸鎂用量和時(shí)間組合下進(jìn)行發(fā)酵得到的結(jié)果,但各因素的影響無法以此說明,故利用SPSS進(jìn)行后續(xù)分析,并構(gòu)建動(dòng)力學(xué)模型。

2.2 靈芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體生長經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型方程的構(gòu)建

表4 回歸方程系數(shù)顯著性分析Table 4 The analysis of regression equation coefficient significance

SPSS線性回歸得到的靈芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體生長經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型方程為:

y=1.836+3.983x3+0.25x4-0.439x1x2-0.423x1x3+0.011x1x4+10.704x2x2-8.82x2x3-0.013x4x4

式(2)

表2 回歸方程擬合度分析Table 2 The analysis of regression equation fitting degree

表3 回歸方程顯著性分析Table 3 The analysis of regression equation significance

2.3 靈芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體生長理論動(dòng)力學(xué)模型方程的構(gòu)建

將表6中的培養(yǎng)基條件參數(shù)代入式(2)得到菌絲干重在不同培養(yǎng)基條件下隨時(shí)間變化的預(yù)測(cè)值,單位為g/100 mL,結(jié)果見表5。

表5 不同培養(yǎng)基條件下菌絲干重的預(yù)測(cè)值Table 5 The predicted value of mycelia dry weight in different medium conditions

將表5中的時(shí)間和菌絲干重預(yù)測(cè)值代入式(1),通過SPSS非線性回歸得到不同培養(yǎng)基條件下Logistic模型方程參數(shù)μm和Cx,max估計(jì)值,結(jié)果見表6。不同培養(yǎng)基條件按U16(163)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行參數(shù)控制,見表6。

表6 U16(163)均勻試驗(yàn)參數(shù)控制表及不同培養(yǎng)基條件下參數(shù)μm和Cx,max估計(jì)值Table 6 Parameters control table of uniform deignU16(163) and estimated values ofμm and Cx,max in different medium conditions

以x1、x2、x3及其二次項(xiàng)x1x1、x1x2、x1x3、x2x2、x2x3、x3x3為自變量,參數(shù)μm和Cx,max為因變量,利用SPSS線性回歸得到關(guān)于培養(yǎng)基各成分的回歸方程?；貧w方法選擇“向后”,設(shè)置使用F的概率“進(jìn)入為0.05,刪除為0.1”。

表7 回歸方程擬合度分析Table 7 The analysis of regression equation fitting degree

表8 回歸方程顯著性分析Table 8 The analysis of regression equation significance

由表9可得參數(shù)μm的回歸方程為:

μm=3.283+0.104x1+3.51x3-0.025x1x1-0.612x1x2-0.418x1x3+10.101x2x2-7.229x2x3

式(3)

表9 回歸方程系數(shù)顯著性分析Table 9 The analysis of regression equation coefficient significance

表12 回歸方程系數(shù)顯著性分析Table 12 The analysis of regression equation coefficient significance

表10 回歸方程擬合度分析Table 10 The analysis of regression equation fitting degree

表11 回歸方程顯著性分析Table 11 The analysis of regression equation significance

由表12可得參數(shù)Cx,max的回歸方程為:

Cx,max=2.891+0.033x1+3.882x3+0.006x1x1-0.386x1x2-0.406x1x3+11.144x2x2-8.604x2x3

式(4)

將式(3)和式(4)代入式(1),即可得到靈芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體生長理論動(dòng)力學(xué)模型方程:

μm=3.283+0.104x1+3.51x3-0.025x1x1-0.612x1x2-0.418x1x3+10.101x2x2-7.229x2x3

Cx,max=2.891+0.033x1+3.882x3+0.006x1x1-0.386x1x2-0.406x1x3+11.144x2x2-8.604x2x3

式中:x1、x2和x3分別為發(fā)酵培養(yǎng)基中米糠、磷酸二氫鉀和七水硫酸鎂的用量,單位g/100 mL;t為發(fā)酵時(shí)間,單位d。

在經(jīng)驗(yàn)和理論動(dòng)力學(xué)模型方程中,x1直接或與其他項(xiàng)的交互作用顯著影響因變量,即培養(yǎng)基中米糠和麩皮用量的配比會(huì)影響發(fā)酵結(jié)果,原因可能是麩皮中總膳食纖維含量比米糠更高。有研究表明,靈芝優(yōu)選木質(zhì)纖維素含量高,且含氮量低的底物[28],因?yàn)殪`芝生長代謝過程中會(huì)分泌木質(zhì)纖維素降解酶,將底物中的木質(zhì)纖維素降解成更易于吸收利用的營養(yǎng)物質(zhì),故可以認(rèn)為麩皮比米糠更有利于靈芝菌體的生長繁殖,此結(jié)論與前期培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果一致。

2.4 靈芝菌絲體生長經(jīng)驗(yàn)與理論動(dòng)力學(xué)模型的比較

將前期優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到的發(fā)酵培養(yǎng)基條件(米糠1 g/100 mL、麩皮9 g/100 mL、磷酸二氫鉀0.15 g/100 mL和七水硫酸鎂0.15 g/100 mL)代入靈芝Ganoderma lucidum JSU LIUYU18液態(tài)發(fā)酵菌體生長經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)和理論動(dòng)力學(xué)模型方程,在同一水平將兩模型方程與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較，論證其可靠性。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo),菌絲干重為縱坐標(biāo),繪制菌絲體生長經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型曲線和理論動(dòng)力學(xué)模型曲線。

由圖1可知,在0～3 d經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型曲線與理論動(dòng)力學(xué)模型曲線相差較大,原因可能是在發(fā)酵初期,由于靈芝菌體進(jìn)入新的培養(yǎng)基環(huán)境,此階段主要滿足菌體自身生長所需,底物消耗少,導(dǎo)致菌絲分離不徹底;同時(shí)絲狀真菌在生長初期會(huì)有一個(gè)快速生長期,此時(shí)期菌體的新陳代謝活躍,生長狀態(tài)變化較快,而兩個(gè)動(dòng)力學(xué)模型均基于每12 h取一次樣的數(shù)據(jù)所得,導(dǎo)致其不足以反應(yīng)靈芝菌株在快速生長期的變化,在第3 d后,兩模型的菌絲干重預(yù)測(cè)值基本一致。

表13 單因素方差分析結(jié)果Table 13 The results of one-way anova

圖1 經(jīng)驗(yàn)和理論動(dòng)力學(xué)模型曲線Fig.1 The curve of empirical and theoretical dynamic model

將實(shí)測(cè)值、經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型和理論動(dòng)力學(xué)模型兩兩進(jìn)行比較,結(jié)果如下:

由表13可知,將實(shí)測(cè)值、經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型和理論動(dòng)力學(xué)模型兩兩進(jìn)行比較時(shí),F均小于Fcrit,P均大于0.05,即三組數(shù)組間差異不顯著。表明經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型和理論動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)測(cè)值之間沒有顯著差異,即得到的經(jīng)驗(yàn)和理論動(dòng)力學(xué)模型能較好地反映靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18菌體的生長狀態(tài)。

3 結(jié)論

本研究通過U24(244)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到不同條件下靈芝發(fā)酵后的菌絲干重,并利用SPSS回歸分析得到靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液態(tài)發(fā)酵菌體生長經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型方程;本研究以Logistic方程為原型根據(jù)經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型得到靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液態(tài)發(fā)酵菌體生長理論動(dòng)力學(xué)模型方程;通過比較兩模型與實(shí)測(cè)值,結(jié)果表明兩模型與實(shí)測(cè)值無顯著差異,即兩模型均能較好地反映發(fā)酵中靈芝菌體生長狀況,為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。