劉小東，鄭小紅，張穩(wěn)穩(wěn)

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)院，重慶 401331)

腫瘤多藥耐藥(MDR)是腫瘤在治療之初存在的和治療過程中逐步形成的對多種結(jié)構(gòu)和機(jī)制不相關(guān)的化療藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象[1]，是腫瘤治療過程中導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的最常見的原因和最棘手的難題，已成為當(dāng)前影響腫瘤治療效果的主要因素和成功化療的最大障礙之一[2]。

MDR的作用機(jī)理十分復(fù)雜，主要包括：藥物外排泵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過度表達(dá)，藥物作用靶點(diǎn)的改變，DNA修復(fù)機(jī)制活性增強(qiáng)，藥物解毒、消除酶的活性增強(qiáng)或表達(dá)增多，腫瘤細(xì)胞凋亡水平的異常，腫瘤干細(xì)胞等[3]。其中，藥物外排泵P糖蛋白(P-gp)過量表達(dá)是目前研究最多，并在體外、體內(nèi)研究中被廣泛驗(yàn)證的經(jīng)典的MDR機(jī)制[4]。

五味子為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥成熟果實(shí)，主要藥理活性成分為五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇乙等聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素，具有保肝、抗氧化、提高免疫功能、改善認(rèn)知功能和抗腫瘤等作用[5]。近年來，大量的研究報道五味子甲素、五味子丙素、五味子酯甲能通過抑制 P-gp或多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)克服MDR,而對五味子酯乙的研究目前少有報道[6-7]，本文旨在研究探討五味子酯乙對肺癌耐紫杉醇A549/Tax細(xì)胞的MDR逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

五味子酯乙為白色微灰粉末，純度≥99.0%，DMSO配制使用。 MTT(貨號: M8180)、紫杉醇(貨號：IP0020)、阿霉素(貨號：D8740)、RIRA裂解液(貨號：R0010)、維拉帕米(貨號：IV0040)、DMEM培養(yǎng)基(貨號: 12100)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(貨號：T1300)購自索萊寶公司。青-鏈霉素溶液(貨號：SV30010)、胎牛血清(貨號：SH30084)購自美國HyClone公司。P-gp(貨號：ab170904)一抗購自美國Abcam公司。IRDye680RD二抗(貨號：925-68071)購自基因有限公司。β-actin(貨號：sc-8432)一抗購自美國Santa Cruz公司。Pgp-GloTMAssay Systems試劑盒(貨號：V3591)購自美國Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌A549及其耐紫杉醇細(xì)胞株A549/Tax細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)-鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液化傳代，A549/Tax在含0.02μmol/L 的紫杉醇的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 MTT分析

對數(shù)生長期A549細(xì)胞(1500個/孔)和A549/Tax細(xì)胞(3000個/孔)接種于96孔板，培養(yǎng)貼壁，梯度濃度的紫杉醇、阿霉素和/或五味子酯乙繼續(xù)培養(yǎng)3 d，棄培養(yǎng)液，每孔加入0.5mg/mL MTT 100 μL的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h，棄去MTT,每孔加入DMSO 180 μL，充分震蕩，酶標(biāo)儀(Thermo，美國)570 nm波長測定OD值。細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-藥物處理OD值/對照組OD值)×100%。GraphpadPrism軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。根據(jù) IC50值計算耐藥指數(shù)(RI)和耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(FR)，RI= IC50耐藥細(xì)胞/ IC50親本細(xì)胞；FR=IC50化療藥物/IC50化療藥物+五味子酯乙。

1.4 細(xì)胞內(nèi)阿霉素蓄積分析

對數(shù)生長期A549/Tax細(xì)胞(1×106個/孔)接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)貼壁后，10 μmol/L 阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合五味子酯乙繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀(BD，美國)檢測熒光強(qiáng)度，蓄積倍數(shù)(FA)=熒光強(qiáng)度阿霉素+五味子酯乙/熒光強(qiáng)度阿霉素。

1.5 P-gp ATPase 活性分析

Pgp-GloTMAssay Systems檢測分析五味子酯乙對P糖蛋白ATPase活性的影響。96孔化學(xué)發(fā)光板中，五味子酯乙或P-gp底物維拉帕米 (150 μmol/L) 37°C下作用重組人源P-gp細(xì)胞膜30 min，加入P糖蛋白ATPase特異性抑制劑釩酸鈉(Na3VO4，150 μmol/L)和 MgATP(50 mmol/L)，37℃孵育1h，加入25μL ATP檢測試劑，繼續(xù)孵育20 min。酶標(biāo)儀(Thermo，美國)檢測熒光信號強(qiáng)度。P-gp ATPase活性以熒光信號強(qiáng)度差值表示。

1.6 Western blot

RIRA裂解液冰上裂解藥物處理的A549/Tax細(xì)胞15 min，4℃、12000 g離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，采用8%聚丙烯酰胺分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行電泳分離后濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1.5 h后，將一抗用封閉液稀釋至相應(yīng)濃度(P-gp(1∶1000)，β-actin(1∶5000))，將封閉后的膜在一抗TBST液中4℃雜交過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，將洗滌后的膜在二抗TBST工作液(1:10000)中，室溫避光孵育2 h，TBST洗膜6次，每次5 min，Odyssey CLx成像系統(tǒng)檢測和定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 A549/Tax細(xì)胞過表達(dá)P-gp

Western blot檢測耐紫杉醇的A549/Tax細(xì)胞及敏感親本A549細(xì)胞中P-gp的表達(dá)情況。如圖1A所示，MDR表型的A549/Tax細(xì)胞中，P-gp的表達(dá)水平顯著高于敏感親本A549細(xì)胞(P<0.01)，而且P-gp的差異性表達(dá)與A549/Tax細(xì)胞的耐藥指數(shù)密切相關(guān)，A549/Tax細(xì)胞對紫杉醇和阿霉素的耐藥指數(shù)高達(dá)20.3和11.5倍(表1)，表明A549/Tax細(xì)胞的多藥耐藥表型是由P-gp的過表達(dá)引起的。

圖1 (A)P-gp在耐藥A549/Tax細(xì)胞及敏感親本A549細(xì)胞中的差異化表達(dá)和(B)五味子酯乙對A549/Tax及A549細(xì)胞增殖的影響

2.2 五味子酯乙對紫杉醇和阿霉素抗A549/Tax細(xì)胞增殖活性的影響

MTT法檢測五味子酯乙單獨(dú)或聯(lián)合紫杉醇、阿霉素處理對耐藥A549/Tax細(xì)胞及敏感A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如圖1B所示，5.0 μmol/L濃度以下五味子酯乙單獨(dú)作用時，A549/Tax和A549細(xì)胞的存活率均大于90%，因此在后續(xù)研究中使用非細(xì)胞毒濃度的五味子酯乙(1.0、2.5、5.0 μmol/L)。

如表1所示，五味子酯乙顯著增強(qiáng)P-gp過量表達(dá)的多藥耐藥A549/Tax細(xì)胞對P-gp底物紫杉醇和阿霉素的抗腫瘤活性，且呈劑量依賴性，5.0 μmol/L五味子酯乙與紫杉醇和阿霉素聯(lián)用的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為11.6和13.8，恢復(fù)了耐藥A549/Tax細(xì)胞對紫杉醇和阿霉素的敏感性(P<0.01)。相反，五味子酯乙與紫杉醇和阿霉素聯(lián)用不影響親本A549對化療藥物的敏感性。這些結(jié)果表明五味子酯乙可增強(qiáng)MDR細(xì)胞對P-gp底物化療藥物的抗增殖活性，逆轉(zhuǎn)P-gp過表達(dá)誘導(dǎo)的MDR。

表1 五味子酯乙對紫杉醇和阿霉素抗A549/Tax和A549細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 五味子酯乙對P-gp藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響

如圖4A和B所示，與對照(1.0 μmol/L阿霉素單獨(dú)處理3 h)相比，5.0 μmol/L五味子酯乙或10 μmol/L維拉帕米與阿霉素聯(lián)合處理顯著增加P-gp過表達(dá)的A549/Tax細(xì)胞內(nèi)P-gp底物阿霉素的蓄積，5.0 μmol/L五味子酯乙和10 μmol/L維拉帕米聯(lián)用的蓄積倍數(shù)(RA)值分別為4.3和3.9(P<0.01)，提示五味子酯乙與P-gp競爭性底物抑制劑維拉帕米相似，能抑制P-gp的藥物外排功能，從而增加A549/Tax細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度。

P-gp的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能與ATPase的水解作用相耦合,因此進(jìn)一步檢測分析了五味子酯乙對P-gp ATPase活性的影響。如圖2C所示，與P-gp競爭性底物維拉帕米(150 μmol/L)單獨(dú)作用相似，5.0 μmol/L五味子酯乙可顯著增加P-gp ATPase的活性(P<0.01)，且作用強(qiáng)于維拉帕米，提示五味子酯乙很可能也是P-gp的底物，在被P-gp外排轉(zhuǎn)運(yùn)時，消耗ATP，激活P-gp ATPase活性。

圖2 (A、B)五味子酯乙對A549/Tax細(xì)胞內(nèi)阿霉素攝取和(C) P-gp ATPase活性增的影響,與對照組相比，** P<0.01

2.4 五味子酯乙對P-gp蛋白水平的影響

Western blot分析檢測五味子酯乙對P-gp蛋白水平的影響。如圖3A和B所示，5.0 μmol/L五味子酯乙處理A549/Tax細(xì)胞72 h能顯著降低P-gp表達(dá)(P<0.05)，而10 μmol/L維拉帕米作用72 h對P-gp的水平無影響，表明五味子酯乙不僅抑制P-gp的藥物外排功能，同時也能下調(diào)P-gp的表達(dá)，從而限制P-gp的活性，逆轉(zhuǎn)A549/Tax細(xì)胞因P-gp過表達(dá)誘導(dǎo)的MDR。

圖3 五味子酯乙對P-gp 表達(dá)的影響，與對照組相比，*P < 0.05

3 討論

藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp過表達(dá)誘導(dǎo)的MDR已成為惡性腫瘤成功化療的主要障礙之一，臨床中90%以上的化療失敗和復(fù)發(fā)與其相關(guān)，因此被作為臨床腫瘤患者預(yù)后的評價指標(biāo)之一[3-8]。P-gp具有廣泛的底物譜，臨床常用的化療藥物幾乎都是其底物，近年來大量的研究旨在通過限制P-gp克服MDR[9]。本研究顯示，P-gp在耐紫杉醇的A549/Tax細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于親本敏感的A549細(xì)胞，并且P-gp的差異性高表達(dá)與耐藥A549/Tax細(xì)胞對P-gp底物紫杉醇和阿霉素的耐藥性密切相關(guān)，而非細(xì)胞毒性濃度的五味子酯乙與紫杉醇或阿霉素聯(lián)用時能顯著增強(qiáng)A549/Tax細(xì)胞對上述兩種化療藥物的敏感性，表明A549/Tax細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象是由P-gp過表達(dá)引起的，五味子酯乙則展示出高效的MDR逆轉(zhuǎn)作用。

P-gp 屬于ATP 結(jié)合盒式結(jié)構(gòu)超家族成員，是由MDR1基因編碼的分子量約為170kD的磷酸糖蛋白。P-gp由兩個同源性片段組成，每一片段又含有6個跨膜區(qū)和1個 ATP 結(jié)合區(qū)，具有ATP 依賴性的藥物外排泵功能，能將藥物泵出細(xì)胞膜外而降低胞內(nèi)藥物濃度[10]。小分子抑制劑或其它技術(shù)手段可通過抑制P-gp的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能和/或下調(diào)其蛋白表達(dá)水平克服其誘導(dǎo)的MDR[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，五味子酯乙與P-gp競爭性底物抑制劑維拉帕米相似，能激活P-gp ATPase活性，底物競爭性抑制P-gp底物化療藥物阿霉素的外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)五味子酯乙能顯著降低耐藥的A549/Tax細(xì)胞中P-gp的過表達(dá)，對P-gp的外排功能和蛋白表達(dá)進(jìn)行雙重抑制。

綜上所述，作為中醫(yī)臨床常用藥五味子的有效成分之一[13]，五味子酯乙通過抑制P-gp的藥物外排功能和下調(diào)其蛋白表達(dá)，在體外能高效逆轉(zhuǎn)肺癌耐紫杉醇A549/Tax細(xì)胞對多種化療藥物的耐藥性，有望克服臨床中P-gp過表達(dá)誘導(dǎo)的MDR，但仍需體內(nèi)研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。