張健龍，易 科，張一嵐，趙一迪，晁漫寧,，談宏斌，孫風麗,，奚亞軍,，張 超,

(1. 西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院，陜西楊凌 712100；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，陜西楊凌 712100；3. 陜西省種業(yè)集團有限責任公司，西安 710016)

小麥是中國三大糧食作物之一，其生產(chǎn)對保障國家糧食安全具有重要意義[1]。同時，中國是一個水資源短缺、干旱頻發(fā)的國家[2]，干旱嚴重影響小麥主產(chǎn)區(qū)的小麥產(chǎn)量和質(zhì)量，提高小麥抗旱能力和水分利用效率是解決北方麥區(qū)產(chǎn)量低而不穩(wěn)的關(guān)鍵，而選育抗旱品種是解決小麥干旱脅迫最經(jīng)濟有效的措施之一[3]。因此，抗旱育種成為小麥育種的主要方向之一，其中優(yōu)異種質(zhì)資源的發(fā)掘利用是抗旱育種的關(guān)鍵基礎(chǔ)。

彩粒小麥是指籽粒種皮或糊粉層顏色與生產(chǎn)上常用小麥不同的小麥，報道的有紫粒、黑粒、藍粒等。研究表明，彩粒小麥富含蛋白質(zhì)和對人體有益的微量元素或礦物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值和良好的保健作用[4]。彩粒小麥富含花青素，有利于去除逆境下產(chǎn)生的活性氧。但目前對于彩粒小麥品質(zhì)研究較多，對抗旱性研究罕見報道?？购当硇丸b定與生理生化指標測定相結(jié)合對小麥優(yōu)異種質(zhì)資源進行苗期抗旱性鑒定具有快速和相對準確的特點[5]。植株生理生化指標主要包含葉片相對含水量(leaf relative water content, RWC)、光合系統(tǒng)相關(guān)參數(shù)(葉綠素熒光參數(shù)測定等)、脯氨酸質(zhì)量分數(shù)、葉綠素質(zhì)量分數(shù)等[6-9]。本試驗將以旱地小麥區(qū)試對照品種‘晉麥47’為對照，選取9份彩粒小麥及其與主栽品種的雜交后代純合株系為材料，利用抗旱表型鑒定與植株生理生化指標測定相結(jié)合的方法研究干旱脅迫對不同彩粒小麥生長發(fā)育的影響，以期為小麥抗旱育種和抗旱分子機理解析提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及種植條件

供試小麥材料為彩粒小麥及其與主栽品種雜交后代純系材料，對照為旱地小麥區(qū)試對照品種‘晉麥47’，具體信息參見表1，本試驗為便于表述分別以1～10號作為標識。

試驗于2018-2019年在西北農(nóng)林科技大學南校區(qū)溫室進行。選取飽滿一致種子在25 ℃催芽24 h，發(fā)芽種子移入塑料盆中進行盆栽。試驗采用規(guī)格為7 cm × 7 cm × 7 cm且底部帶孔的塑料盆，盆栽用土為蛭石與基質(zhì)2∶1混合，每盆裝土90 g，定苗4株。試驗設(shè)3個生物學重復，每個重復含4盆，共16株苗。試驗分對照組和處理組，每12盆放于一個塑料盤中，塑料盤貼對應(yīng)標簽。溫室光照為自然光，每天17:00-22:00進行補光處理，以1/3 Hoagland溶液澆灌補充水分。

表1 供試材料編號和遺傳背景Table 1 Number and genetic background of tested materials

1.2 試驗處理和樣品制備

移栽后10 d澆灌至土壤飽和含水量，開始對處理組進行自然干旱脅迫。干旱脅迫過程中，對照組正常管理，處理組每天停止?jié)补嗤瑫r盤內(nèi)盤間位置無規(guī)則變動，干旱處理結(jié)束后進行拍照和葉綠素熒光測定。

干旱處理采用不澆水方式進行，10 d后1號小麥(對照：‘晉麥47’)葉片萎蔫，土壤相對含水量降至10%以下，此時測定土壤和葉片相對含水量、葉片光合作用等相關(guān)指標。取樣后繼續(xù)干旱處理，在約50%苗處在瀕死狀態(tài)時以1/3 Hoagland營養(yǎng)液進行復水，4 d后統(tǒng)計成活率。

土壤相對含水量和葉片相對含水量均采用烘干法稱重法測量。測定土壤相對含水量時，每種樣品的不同處理共取3個重復，每個重復取盆中部距表層1～3 cm土壤約5～15 g。隨機選取4盆澆灌至飽和含水量后取樣測量飽和含水量。測定葉片相對含水量時，每種樣品的不同處理共取3個重復，每個重復取不同盆中的2～4片旗葉，剩余旗葉放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

土壤相對含水量=(初始濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/(飽和濕質(zhì)量-干質(zhì)量)×100%

葉片相對含水量=(初始鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/(飽和鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)×100%

1.3 光合作用相關(guān)參數(shù)測定

選取同一處理不同盆中長勢相同植株，在旗葉的相同位置使用Dual-PAM-100(德國 WALZ)測量葉綠素熒光參數(shù)，每處理6次生物學重復。

1.4 葉綠素和游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)測定

采用80% 丙酮比色法測定葉綠素質(zhì)量分數(shù)[10]，采用酸性茚三酮法測定游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)[11]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗均設(shè)3個以上生物學重復，試驗結(jié)果以“平均值±標準誤”的形式表示，采用 Microsoft Excel 2016 軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，SPSS 25.0 統(tǒng)計分析軟件檢測差異顯著性和多重比較(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對不同彩粒小麥材料表型和成活率的影響

在持續(xù)干旱10 d后，1號小麥(對照：‘晉麥47’)出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，此時測定土壤相對含水量已降至5%以下(圖1-A)，屬于極端重度干旱脅迫[12]。與正常澆水的對照組相比，干旱脅迫導致小麥植株生長緩慢，但嚴重干旱脅迫時不同小麥植株萎蔫程度存在顯著差異：6、9、10號小麥萎蔫最嚴重；1、3、8號小麥萎蔫較輕，葉卷曲較為明顯，與3、8號小麥相比，1號小麥植株較挺拔；2、7號小麥葉部平展，萎蔫程度與1號小麥相似；4、5號小麥與其他小麥相比沒有明顯的葉卷曲現(xiàn)象，并且植株較為挺拔，其中5號小麥葉色與其他小麥相比較淺(圖2-A)。繼續(xù)進行干旱脅迫，待50%植株處于瀕死狀態(tài)時進行復水處理，4 d后統(tǒng)計成活率發(fā)現(xiàn)，2、4、5、7號小麥復水后的成活率與1號小麥無顯著差異，3、6、8、9、10號小麥復水后成活率小于1號小麥，其中9號小麥復水后成活率最低(圖2-B)。綜合干旱脅迫下的表型觀察和成活率數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知， 2、4、5、7號小麥抗旱性較好，其中4和5號小麥表現(xiàn)最為突出。

誤差線上不同字母表示同一處理不同材料間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 干旱脅迫對不同彩粒小麥材料旗葉相對含水量的影響

葉片相對含水量是植株重要的水分狀況指標，密切反映水分供給與蒸騰之間的關(guān)系。干旱脅迫條件下，作物葉片相對含水量可作為品種抗旱性鑒定的重要指標，并且葉片相對含水量和作物產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)[13-15]。在干旱脅迫進行到10d時，對照品種‘晉麥47’發(fā)生萎蔫，土壤處于極端重度干旱脅迫條件。此時，對不同類型小麥旗葉相對含水量進行了測定。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2、6、9、10號小麥葉片相對含水量與對照組相比顯著下降，1、3、4、5、7、8號小麥葉片相對含水量下降不顯著(圖1-B)。在干旱處理組中，6、9、10號小麥葉片相對含水量顯著低于1號對照品種，其他小麥與1號小麥差異不顯著(圖1-B)。結(jié)合表型分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)葉片相對含水量變化趨勢與土壤相對含水量呈現(xiàn)一定相關(guān)，但不同材料間差異顯著，揭示了不同小麥材料抗旱性存在差異。

A.植株表型；B.復水后成活率

2.3 干旱脅迫對不同彩粒小麥材料光合作用相關(guān)參數(shù)的影響

光合作用是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，且在干旱條件下變化較為顯著，是小麥抗旱性生理鑒定的重要組成部分[16-17]。經(jīng)過暗適應(yīng)的旗葉在測定熒光誘導動力學參數(shù)中，可變熒光(Fv)與最大熒光(Fm)的比值(Fv/Fm)代表光系統(tǒng) Ⅱ 的最大光合效率。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫均導致旗葉Fv/Fm有所下降，不同小麥間的下降幅度存在顯著差異，其中5號小麥變化不顯著。9、10號小麥下降幅度分別為3.0%和4.8%，顯著大于1號小麥，2、4、6、7號小麥下降幅度小于1號小麥，其中4號小麥下降幅度最小為1.1%(圖3-A,B)。表明干旱脅迫對4、5號小麥的光系統(tǒng) Ⅱ 的損傷較小，而對9、10號小麥損傷較大。

葉綠素熒光產(chǎn)量下降(淬滅)可以由光合作用的增加引起，也可以由熱耗散的增加引起。由光合作用引起的熒光淬滅稱之為光化學淬滅(qP)，由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學淬滅(qN)。qP反映光系統(tǒng) Ⅱ 天線色素吸收的光能用于光化學反應(yīng)的份額，qN反映光系統(tǒng) Ⅱ 反應(yīng)中心通過熱耗散掉的光能大小[18]。測定結(jié)果顯示，干旱脅迫均導致不同小麥的qP顯著下降，其中10號小麥下降幅度最大為57.3%。處理組中3、10號小麥的qP顯著小于1號小麥，其他小麥與1號小麥相比差異不顯著(圖3-C)。不同小麥的qN對干旱脅迫的反應(yīng)存在差異，10號小麥qN顯著下降，3、4號小麥qN變化不顯著，其他小麥qN顯著增加，處理組中，2、3、5、6、8、9號小麥顯著大于1號小麥的qN(圖3-D)。表明在干旱脅迫下1、2、4、5、6、7、8、9號小麥光系統(tǒng) Ⅱ 的電子傳遞活性較大，并且能維持較高的效率完成光系統(tǒng) Ⅱ 將捕獲的光能轉(zhuǎn)換成化學能。光合電子傳遞總是與形成的光合磷酸化相耦聯(lián)，非環(huán)式電子傳遞鏈的最終電子受體是NADPH+，因此較高的光系統(tǒng) Ⅱ 電子傳遞活性有助于形成更多的ATP和NADPH供碳同化之需，從而形成更多的光合產(chǎn)物[19-20]。5號小麥qN最大，表明其可以更好通過熱耗散釋放多余的光能，從而更好的保護光合器官。

圖3 不同小麥材料的葉綠素熒光參數(shù)Fig.3 Chlorophyll fluorescence parameters of different wheat materials

ETR(Ⅰ)和ETR(Ⅱ)分別表示光系統(tǒng) Ⅰ 和光系統(tǒng) Ⅱ 的相對電子傳遞速率。測定結(jié)果顯示，與對照相比，干旱脅迫導致1、2、7、8、9、10號小麥ETR(Ⅱ)顯著下降，其中10號小麥下降幅度最大為54.9%，處理組中，9、10號小麥顯著低于1號小麥。干旱脅迫下1、6、8、9號小麥ETR(Ⅰ)與對照相比顯著下降，其中9號小麥下降幅度最大(圖3-E，F(xiàn))。表明干旱脅迫對9、10號小麥光合電子傳遞影響較大，而3、4、5號小麥依舊可以將受激發(fā)的電子高效地進行傳遞，保障光合作用正常進行。

2.4 干旱脅迫對不同彩粒小麥材料葉綠素質(zhì)量分數(shù)的影響

小麥生長發(fā)育過程中，功能葉片的葉綠素質(zhì)量分數(shù)直接影響光合作用和光合產(chǎn)物的形成[8,21]。研究表明經(jīng)一定程度的干旱處理后，植株會表現(xiàn)出一定抗旱性，即葉綠素質(zhì)量分數(shù)的上升，但在長時間干旱條件下，植株趨于衰敗[22]。測定結(jié)果顯示，干旱脅迫導致小麥旗葉的葉綠素質(zhì)量分數(shù)顯著增加，而不同小麥葉綠素質(zhì)量分數(shù)的增加幅度存在差異，其中9、10號小麥干旱脅迫條件下葉綠素質(zhì)量分數(shù)分別增加了5.7倍和4.6倍，4號小麥增幅僅為51.1%(圖4-A)。處理組中不同材料葉綠素質(zhì)量分數(shù)、葉綠素a質(zhì)量分數(shù)(chlorophyll content a, Chl a)和葉綠素b(chlorophyll content, Chl b)質(zhì)量分數(shù)變化趨勢相似。其中7號小麥葉綠素a和葉綠素b顯著下降 15.5%和23.3%，干旱脅迫導致除7號小麥以外的其他小麥材料葉綠素a和葉綠素b質(zhì)量分數(shù)的顯著增加，且兩者的增加趨勢相同，其中9號小麥葉綠素a和葉綠素b質(zhì)量分數(shù)增幅最大，分別是對照的5.6倍和6.0倍(圖4-B)。結(jié)合表型鑒定結(jié)果表明，本試驗干旱脅迫時間較短，植株葉片仍保持綠色，體內(nèi)葉綠素沒有大量降解，葉綠素質(zhì)量分數(shù)與葉片鮮質(zhì)量存在較大相關(guān)性，變化幅度較大，但在一定程度上反映了不同材料抗旱性的差異。

圖4 不同小麥材料的葉綠素質(zhì)量分數(shù)及組分Fig.4 Chlorophyll contents and components of different wheat materials

2.5 干旱脅迫對不同彩粒小麥材料葉片游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的影響

干旱脅迫下游離脯氨酸是小麥的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的增高能夠降低葉片細胞的滲透勢，防止細胞脫水，同時保護細胞膜系統(tǒng)，維持胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)[23]。在本試驗對照組中，5、9號小麥與1號小麥游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)無明顯差異，其余小麥游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)均顯著高于1號小麥。處理組中，2、4、5號小麥游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)顯著低于1號小麥，3、6、9號小麥顯著高于1號小麥。與對照相比，干旱脅迫導致小麥游離脯氨酸顯著增加，不同小麥增加幅度存在明顯差異，其中3、6、9號小麥增幅大于1號小麥(表2)。結(jié)合葉片相對含水量分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢與葉片相對含水量的變化趨勢有一定的相關(guān)性。

表2 不同小麥材料的脯氨酸質(zhì)量分數(shù)Table 2 Proline content in different wheat materials

2.6 不同測定指標之間的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，土壤相對含水量與各個參數(shù)之間均呈現(xiàn)顯著的相關(guān)關(guān)系，其中與葉片相對含水量(RWC)之間呈極顯著的正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)最高為0.782。而葉片相對含水量(RWC)與復水后成活率、葉綠素質(zhì)量分數(shù)、脯氨酸質(zhì)量分數(shù)之間為極顯著的相關(guān)性(表3)。表明各個參數(shù)均可在顯著水平上反映土壤水分的變化情況，而土壤水分的變化對葉片含水量影響較大，葉片水分的變化對復水后成活率、葉綠素質(zhì)量分數(shù)、脯氨酸質(zhì)量分數(shù)影響較大。

表3 不同測定指標的相關(guān)性Table 3 Relevance of different parameters

3 討 論

干旱處理直接影響小麥植株的生長發(fā)育，干旱脅迫下小麥的萎蔫程度、株高、葉面卷曲程度等均可作為植株抗旱性鑒定的指標[4]。本試驗中，當土壤相對含水量達到嚴重干旱脅迫的情況下，不同小麥的植株形態(tài)存在顯著差異，與1號小麥(對照：‘晉麥47’)相比，4、5號小麥在干旱脅迫下表現(xiàn)出更強的適應(yīng)能力，而6、9、10號小麥適應(yīng)能力較差，其余小麥無明顯差異。因此推測4、5號小麥的抗旱性強于1號小麥，2、3、7、8號小麥抗旱性與1號小麥相似。通過測定小麥旗葉的相對含水量的結(jié)果同樣表明4、5號小麥干旱脅迫下依舊能保持較高的葉片含水量，從而緩解干旱對植株形態(tài)的影響。而6、9、10號小麥的水分供求對干旱脅迫更敏感。相關(guān)性分析結(jié)果顯示復水后成活率與葉片相對含水量存在極顯著的正相關(guān)，說明葉片相對含水量可作為抗旱性鑒定的重要生理指標。

干旱脅迫導致小麥光系統(tǒng)Ⅱ的光化學過程發(fā)生混亂，葉綠素熒光動力學參數(shù)變化靈敏，其變化程度可以用來鑒別小麥忍耐干旱的能力，目前認為抗旱能力愈強，葉綠素熒光動力學參數(shù)的變化程度愈小。Fv/Fm被認為是反應(yīng)植物光抑制程度的可靠指標，其變化程度可作為小麥抗旱性鑒定的重要指標[5,24-25]。Fv/Fm、qP、qN、ETR等葉綠素熒光參數(shù)的測定結(jié)果表明干旱脅迫下4、5號小麥能維持良好的光合作用，9、10號小麥光合作用對干旱脅迫較為敏感，而其他小麥的光合作用與1號小麥相似。相關(guān)性分析結(jié)果表明葉綠素熒光參數(shù)與葉片相對含水量、土壤相對含水量之間存在顯著的相關(guān)性，從而表明葉綠素熒光參數(shù)在小麥抗旱鑒定方面具有一定可靠性。Fv/Fm、qN、ETR(Ⅰ)與復水后成活率之間無顯著的相關(guān)性，推測是由于不同小麥的Fv/Fm、qN、ETR(Ⅰ)正常生長條件下存在顯著差異，而復水后成活率統(tǒng)計時認為不同小麥在正常生長過程中沒有差異或者差異很小。

在水分脅迫下，葉片中葉綠素質(zhì)量分數(shù)發(fā)生變化，但抗旱性品種比不抗旱品種變化幅度小[22]。本試驗中，雖然土壤相對含水量達到嚴重干旱脅迫的水平，但由于干旱脅迫時間較短，旗葉水分大量流失，樣品質(zhì)量急劇下降，所以導致大多數(shù)小麥葉綠素及其組分含量顯著增加。相關(guān)性分析結(jié)果顯示葉綠素質(zhì)量分數(shù)與葉片含水量達到極顯著的相關(guān)，亦證明了上述觀點。 4號小麥變化幅度最小，9、10號小麥變化幅度較大，表明4號小麥的葉綠素調(diào)控對干旱具有較強的適應(yīng)性。結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉綠素質(zhì)量分數(shù)與復水后成活率達到極顯著的相關(guān)，表明葉綠素質(zhì)量分數(shù)可作為小麥抗旱性鑒定的參考指標。干旱脅迫導致葉綠素質(zhì)量分數(shù)升高，但Fv/Fm顯著下降，推測是干旱脅迫使葉片水分的大量流失，導致水分成為光合作用的限制因子，雖然9、10號小麥葉綠素質(zhì)量分數(shù)較高，但其葉片相對含水量較低，從而導致其Fv/Fm較低。

脯氨酸作為細胞質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑在干旱脅迫中發(fā)揮重要作用[26]。本試驗中，干旱脅迫下葉片脯氨酸質(zhì)量分數(shù)顯著增加，表明植株在干旱條件下通過增加脯氨酸質(zhì)量分數(shù)來調(diào)節(jié)水分供求關(guān)系。2、4、5、7、8、10號小麥與1號小麥相比脯氨酸質(zhì)量分數(shù)無顯著變化，表明其在干旱脅迫下的滲透調(diào)節(jié)和防脫水能力與1號小麥相似。相關(guān)性分析中，脯氨酸質(zhì)量分數(shù)與復水后的成活率、葉片相對含水量存在極顯著的相關(guān)。干旱脅迫下植株體內(nèi)水分的大量流失導致較多脯氨酸的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)植株水分的供求平衡。在本試驗中，脯氨酸質(zhì)量分數(shù)越高表明植株失水越嚴重，受到干旱脅迫的損傷越大。

綜合抗旱表型鑒定與生理生化指標測定結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)4號(‘ZHW’/‘小偃22’雜交后代)和5號(‘0705-39’/‘INDB’雜交后代)彩粒小麥的抗旱性優(yōu)于對照，9、10號小麥對干旱脅迫較為敏感，2、3、6、7、8號小麥抗旱性與對照無顯著差異。2份經(jīng)過表型與生理生化指標抗旱性鑒定篩選的彩粒小麥新材料對干旱脅迫具有較好的適應(yīng)性，有望成為新的抗旱種質(zhì)資源用于旱地小麥育種和抗旱分子機制解析。