瞿根義，湯乘，徐勇，柳成孟，陽光，段紅桃，向茂林

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的疾病之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，全世界每年超過43萬例患者被診斷為膀胱癌，并有16.5萬例患者死于膀胱癌[1]。在中國，膀胱癌的發(fā)病率為7.68/10萬，在泌尿系腫瘤發(fā)病率中居首[2]。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最主要的類型，目前最主要的治療方式是手術(shù)切除，但術(shù)后易反復(fù)、預(yù)后差且缺乏有效的生物標(biāo)志物，對于膀胱尿路上皮癌具體的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制也尚不清楚。因此，尋求膀胱尿路上皮癌有效預(yù)防和控制復(fù)發(fā)的方案一直是研究的熱點(diǎn)。生物信息學(xué)是將計算機(jī)技術(shù)和分子生物學(xué)相結(jié)合的技術(shù)，為基因的研究提供了明確的方向，可揭示大量生物信息。癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA) 和Oncomine數(shù)據(jù)庫作為當(dāng)前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫，具有大樣本和豐富臨床數(shù)據(jù)的優(yōu)勢。本研究通過TCGA和Oncomine數(shù)據(jù)庫深入挖掘膀胱尿路上皮癌差異表達(dá)基因，進(jìn)行差異基因GO富集分析和KEGG通路富集分析，制作蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，篩選關(guān)鍵基因(Hub gene)，并且進(jìn)一步通過Oncomine數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Meta分析，以挖掘膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，為膀胱尿路上皮癌的靶向精準(zhǔn)治療提供研究基礎(chǔ)，報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 登陸TCGA 數(shù)據(jù)庫(https：//cancergenome.nih.gov/)網(wǎng)站下載公開的膀胱尿路上皮癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中膀胱尿路上皮癌樣本414例，正常癌旁組織19例。

1.2 方法

1.2.1 獲取差異基因：應(yīng)用R 語言軟件(3.5.3版本)中的edgeR 軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及差異表達(dá)分析，篩選log2FC 絕對值>1.5，錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05 的基因?yàn)楸磉_(dá)差異基因。ggplot2軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形可視化。

1.2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG富集分析：通過DAVID 數(shù)據(jù)庫( https://david.ncifcrf.gov)對篩選的顯著差異基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，應(yīng)用R語言軟件及相應(yīng)的clusterProfiler包進(jìn)行注釋及可視化。

1.2.3 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析：STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)用于識別已知和預(yù)測PPI[3]。使用STRING對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，使用 Cytoscape軟件中的Cytohubba篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的前10位Hub基因。

1.2.4 Oncomine數(shù)據(jù)庫提取Hub基因在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)數(shù)據(jù)并進(jìn)行Meta分析：在Oncomine數(shù)據(jù)庫中(https://www.oncomine.org)進(jìn)行檢索。檢索條件：(1)Gene：hub基因名；(2)Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；(3) Cancer Type：Bladder urothelial carcinoma；(4) THRESHOLD BY：P-VALUE<0.0001，F(xiàn)OLD CHANGE>2，GENE RANK=Top 10%。獲取Oncomine數(shù)據(jù)庫中Hub基因與膀胱尿路上皮癌的相關(guān)數(shù)據(jù)，并以P<0.05篩選數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行Meta分析。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱尿路上皮癌差異表達(dá)基因篩選 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載膀胱尿路上皮癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中膀胱尿路上皮癌樣本414例，正常癌旁組織19例。對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化、對數(shù)化，將沒有對應(yīng)基因注釋信息的探針和重復(fù)的探針去掉，最終得到18 768個基因，433個樣本的表達(dá)譜。通過edgeR軟件包，以log2FC絕對值>1.5，F(xiàn)DR<0.05為差異表達(dá)基因篩選條件，共篩選出膀胱尿路上皮癌差異表達(dá)基因1 650個，其中表達(dá)上調(diào)基因565個，表達(dá)下調(diào)基因1 085個，并繪制基因火山圖，見圖1。

2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路富集分析 通過GO富集分析和KEGG通路富集分析篩選差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，在GO富集分析中包括生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cell composition，CC)和分子功能(molecular function，MF)，在BP中差異基因主要富集于鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞外基質(zhì)組織和RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控，在CC中差異基因主要富集于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外空間和質(zhì)膜，在MF中差異基因主要富集于轉(zhuǎn)錄激活子活性、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合和序列特異性DNA結(jié)合。在KEGG通路分析中主要富集于cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路和神經(jīng)活性配體—受體相互作用。見表1、表2和圖2。

表1 膀胱尿路上皮癌差異表達(dá)基因GO富集分析

表2 膀胱尿路上皮癌差異表達(dá)基因 KEGG通路富集分析

2.3 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 通過STRING數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用Cytoscape軟件中的Cytohubba篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中連接程度前10位Hub基因，分別為：GNG7、GNG11、BDKRB2、BDKRB1、NMUR1、NPSR1、CHRM5、TACR2、TAC1、TACR1，見圖3。

2.4 Oncomine數(shù)據(jù)庫Hub基因分析及Meta分析 獲取Oncomine數(shù)據(jù)庫中Hub基因與膀胱尿路上皮癌的相關(guān)數(shù)據(jù)，并以P<0.05篩選數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行Meta分析，獲得1個關(guān)鍵基因?yàn)門ACR1，其在3個分析研究間的比較顯示過表達(dá)，見圖4。

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其中膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最主要的類型，膀胱尿路上皮癌具有發(fā)病率高、易復(fù)發(fā)和預(yù)后差等特征，其發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子眾多，但其具體機(jī)制目前仍不清楚，另外對于膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展及生存預(yù)后缺乏有效的腫瘤標(biāo)志物。因此進(jìn)一步研究膀胱尿路上皮癌具體的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，挖掘有效的生物標(biāo)志物對膀胱尿路上皮癌的診斷治療及預(yù)后評估具有重要的臨床意義。

癌癥基因組圖譜(TCGA) 是由美國癌癥中心和美國人類基因組研究中心在2006 年共同發(fā)起的項(xiàng)目，主要利用高通量測序技術(shù)建成的一個綜合的、多維的癌癥地圖，大大提高了對癌癥發(fā)生、診斷和治療的理解，以及對癌癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識[4]。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)僅能同時研究少數(shù)幾個基因的功能，而生物信息學(xué)是將計算機(jī)技術(shù)和分子生物學(xué)相結(jié)合的技術(shù)，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫的挖掘揭示大量生物信息。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，通過從TCGA下載的膀胱尿路上皮癌基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，共挖掘出膀胱尿路上皮癌差異表達(dá)基因1 650個，其中表達(dá)上調(diào)基因565個，表達(dá)下調(diào)基因1 085個。用DAVID在線工具對差異基因進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BP中差異基因主要富集于肌肉收縮、細(xì)胞外基質(zhì)組織和RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控，在CC中差異基因主要富集于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外空間和質(zhì)膜，在MF中差異基因主要富集于轉(zhuǎn)錄激活子活性、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合和序列特異性DNA結(jié)合。進(jìn)一步通過STRING數(shù)據(jù)庫對膀胱尿路上皮癌差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白調(diào)節(jié)點(diǎn)主要集中在GNG7、GNG11、BDKRB2、BDKRB1、NMUR1、NPSR1、CHRM5、TACR2、TAC1、TACR1等10個基因。進(jìn)一步對Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘并進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)TACR1為膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因[5-6]。

TACR1基因編碼的蛋白為截短型神經(jīng)激肽1受體(neurokinin 1 receptor，NK1R)，NK1R屬于G蛋白偶聯(lián)受體，同P物質(zhì)(SP)的結(jié)合能力最強(qiáng)，是SP的偏嗜性受體[7]。研究顯示，NK1R在疾病和健康狀態(tài)下的功能特點(diǎn)表明其可作為疾病治療的靶點(diǎn)[8-9]。速激肽中SP結(jié)合NK1R后可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成等生物學(xué)過程，且應(yīng)用NK1R拮抗劑可特異性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲[10-11]。研究也證實(shí)，SP通過激活并結(jié)合NK1R發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的通路是抗腫瘤的獨(dú)立靶點(diǎn)[12]。其中在胃癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中NK1R均出現(xiàn)顯著高表達(dá)[13-15]，并且NK1R表達(dá)與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，SP的表達(dá)與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，SP-NK1R可作為乳腺癌診斷治療的新靶點(diǎn)[14]。目前多項(xiàng)研究證實(shí)，NK1R通過調(diào)節(jié)腫瘤的增殖侵襲參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中在Oncomine數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Meta分析顯示，NK1R的靶基因TACR1在膀胱尿路上皮癌中出現(xiàn)顯著高表達(dá)，但目前其在膀胱尿路上皮癌中的機(jī)制尚未闡明，對SP-NK1R進(jìn)行進(jìn)一步研究，對膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制將會有更多的發(fā)現(xiàn)。

本研究致力于挖掘膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵的基因，共發(fā)現(xiàn)1 650個差異表達(dá)基因和1個關(guān)鍵基因TACR1，可能參與調(diào)控膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展，但是，仍需要進(jìn)一步的研究來闡明TACR1在膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的具體生物學(xué)功能，為膀胱尿路上皮癌的治療提供新的線索和方向。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

瞿根義：實(shí)施研究過程，論文撰寫；湯乘：實(shí)施研究過程，資料搜集整理；徐勇、柳成孟：提出研究方向、研究思路，研究選題；陽光、段紅桃：統(tǒng)計學(xué)分析，論文修改；向茂林：數(shù)據(jù)獲取