豆康寧，華向美，黃亞男，李盤欣，韓文鳳，石 曉，王 飛

（1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校河南省休閑食品工程技術(shù)研究中心，河南 漯河 462002；2.漯河出入境檢驗檢疫局，河南 漯河 462002；3.河南南街村（集團(tuán)）有限公司，河南 漯河 462600；4.漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 漯河 462002）

食品中 Nε-(1-羧甲基)-L-賴氨酸（Nε-(1-Carboxyethyl)-L-Lysine）簡稱羧甲基賴氨酸或CML，是晚期糖基化終末產(chǎn)物中最主要代表之一[1]，對人體健康具有一定危害，如能促進(jìn)人體器官的衰老，腎病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展[2]。羧甲基賴氨酸普遍存在于食品中，如烘焙食品、方便面、醬油等[3]。因此，研究抑制羧甲基賴氨酸的生成，對提高食品的質(zhì)量與安全具有重要價值。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑對食品中羧甲基賴氨酸的生成具有抑制作用[4]，該文研究了具有抗氧化性的抑制劑維生素B1、維生素B6、兒茶素、白藜蘆醇、丁基羥基茴香醚（BHA）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）對賴氨酸-葡萄糖生成羧甲基賴氨酸的抑制作用，為食品中羧甲基賴氨酸的控制提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羧甲基賴氨酸(CML)標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，加拿大TRC公司；甲醇、甲酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水:一級純水；維生素B1、維生素B6、兒茶素、白藜蘆醇、BHA、TBHQ：含量 98%，南京納滿生物科技有限公司；葡萄糖、L-賴氨酸，色譜純，sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼酸鈉、硼氫化鈉以及三氟乙酸，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters-XevoTQ型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀、Waters ACQUITY UPLC-BEH Amide型色譜柱，美國Waters公司；YP3001N型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DKU-3型油浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SPE固相萃取小柱，沃特世科技(上海)有限公司，LGJ-18B型冷凍干燥機(jī)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司。

2 試驗方法

2.1 賴氨酸-葡萄糖美拉德模擬反應(yīng)及抑制體系的建立

用50 mmol/L，pH 7.4磷酸鹽緩沖液配制濃度為0.3 mol/L的賴氨酸-葡萄糖的反應(yīng)液，然后按照質(zhì)量百分比添加1%、2%、5%、10%、20%的維生素B1、維生素B6、兒茶素、白藜蘆醇、丁基羥基茴香醚、叔丁基對苯二酚，在100℃油浴條件下加熱20 min后取出各反應(yīng)管，冷卻后備用。

2.2 羧甲基賴氨酸檢測樣品前處理

參考Jialiang等[5]以及 Maria等[6]報道的方法，對2.1反應(yīng)所得的樣品進(jìn)行處理，得HPLC-MS檢測樣品。具體步驟參考文獻(xiàn)[7]中LC-MS/MS法測定CML及CEL含量。

2.3 HPLC-MS檢測條件

流動相：0.1%甲酸:甲醇=7:3，流動相流速為0.5 mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL，運行時間為10 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度為100℃，脫溶劑溫度為300℃，錐孔電壓為20 eV，錐孔氣體流速為50 L/h，脫溶劑氣體流速為350 L/h，載氣為氮氣。選擇性離子監(jiān)測（SIR）：羧甲基賴氨酸準(zhǔn)分子離子質(zhì)荷比m/z 205，離子碎片質(zhì)荷為m/z 130和m/z 84。

2.4 羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法

分別制備濃度為 5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的羧甲基賴氨酸溶液，然后測定響應(yīng)值，建立羧甲基賴氨酸濃度與響應(yīng)值之間的關(guān)系曲線。

2.5 添加劑對羧甲基賴氨酸抑制率的計算

賴氨酸-葡萄糖模擬體系中羧甲基賴氨酸含量的計算公式如下：

X為抑制率；CML為羧甲基賴氨酸。

2.6 數(shù)據(jù)分析

以上所有實驗方法中涉及的實驗數(shù)據(jù)均做平行試驗2次，使用SPSS 18.0數(shù)理統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

濃度為 5ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的羧甲基賴氨酸溶液的液質(zhì)色譜響應(yīng)值R分 別 為 5 153.81、1 010 168.38、18 670.31、37853.33、73 945.83，所建立的曲線方程為 Y=916.97X+732.36，相關(guān)系數(shù) R=0.9998。

圖1為羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品液質(zhì)色譜出峰圖，出峰時間范圍為4.67～4.69 min。圖2為羧甲基賴氨酸特征離子峰，羧甲基賴氨酸的特征離子質(zhì)荷比為205、130、84。圖3為賴氨酸-葡萄糖模擬體系液質(zhì)色譜出峰圖。

圖1 羧甲基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品液質(zhì)色譜出峰圖

圖2 羧甲基賴氨酸的質(zhì)譜特征離子峰

圖3 賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)物液質(zhì)色譜出峰圖

3.2 維生素類添加劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

在賴氨酸-葡萄糖的反應(yīng)液中，按照質(zhì)量百分比分別添加 1%、2%、5%、10%、20%的維生素 B1、維生素B6，維生素B1、維生素B6對羧甲基賴氨酸的抑制率見圖4所示。

圖4 維生素類添加劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

從圖4可知，隨著維生素B1、維生素B6添加量的增加，羧甲基賴氨酸的抑制率逐漸增加，當(dāng)添加量為20%時，維生素B1的抑制率為21.46%，維生素B6的抑制率為9.37%，維生素B1的抑制效果比維生素B6效果好。劉薈萃[8]研究了維生素B1對油炸麻花中羧甲基賴氨酸具有抑制作用。維生素B1抑制羧甲基賴氨酸的機(jī)理，作用方式是通過清除美拉德反應(yīng)生成的活性羰基化合物，進(jìn)而抑制了羧甲基賴氨酸的形成[9-10]。

3.3 多酚類添加劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

在賴氨酸-葡萄糖的反應(yīng)液中，按照質(zhì)量百分比分別添加1%、2%、5%、10%、20%的兒茶素、白藜蘆醇，兒茶素、白藜蘆醇對羧甲基賴氨酸的抑制率見圖5所示。

圖5 多酚類添加劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

從圖5可知，隨著兒茶素、白藜蘆醇添加量的增加，羧甲基賴氨酸的抑制率逐漸增加，當(dāng)添加量為20%時，兒茶素的抑制率為10.95%，白藜蘆醇的抑制率為13.68%，白藜蘆醇的抑制效果比兒茶素抑制效果好。劉慧琳等[11]研究了6種多酚類物質(zhì)對羧甲基賴氨酸的抑制研究，結(jié)果顯示白藜蘆醇的抑制作用最大。周燕瓊[12]研究發(fā)現(xiàn)兒茶素對曲奇餅干中羧甲基賴氨酸的生成具有良好的抑制作用。Rice-E-vans等[13]研究發(fā)現(xiàn)多酚類化合物通過抑制葡萄糖的自氧化反應(yīng)和清除自由基等方式抑制羧甲基賴氨酸的形成。兒茶素、白藜蘆醇為多酚類抗氧化劑，具有抑制羧甲基賴氨酸生成作用。

3.4 化學(xué)合成抗氧化劑對羧甲基賴氨酸的抑制

在賴氨酸-葡萄糖的反應(yīng)液中，按照質(zhì)量百分比分別添加 1%、2%、5%、10%、20%的 BHA、TBHQ，BHA、TBHQ對羧甲基賴氨酸的抑制率見圖6所示。

圖6 化學(xué)合成抗氧化劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

從圖6可知，BHA、TBHQ對羧甲基賴氨酸的生成具有促進(jìn)作用，也即抑制率為負(fù)值，抑制率越小，促進(jìn)作用越大。隨著BHA、TBHQ添加量的增加，羧甲基賴氨酸的抑制率逐漸減小，當(dāng)BHA、TBHQ添加量為20%時，BHA的抑制率為-2.49%，TBHQ的抑制率為-42.13%。這說明BHA對羧甲基賴氨酸的促進(jìn)作用較小，而TBHQ對羧甲基賴氨酸的促進(jìn)作用較大。付如意[14]研究發(fā)現(xiàn)，在食品模擬體系中，具有抗氧化性的維生素C、維生素E對羧甲基賴氨酸無抑制效果。劉紅[15]研究了4種抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ、Vc對多種美拉德模擬體系反應(yīng)的影響，4種抗氧化劑對甘氨酸-葡萄糖體系有顯著影響，對天冬酰胺-葡萄糖體系無顯著影響。因此，有的抗氧化劑具有抑制羧甲基賴氨酸的生成作用，而有的卻沒有，有的甚至還具有促進(jìn)生成作用。

4 結(jié)論

維生素類抗氧化劑維生素B1、維生素B6和多酚類抗氧化劑兒茶素、白藜蘆醇對賴氨酸-葡萄糖生成羧甲基賴氨酸具有抑制作用，抑制率從大到小的順序依次為維生素B1、白藜蘆醇、兒茶素、維生素B6；化學(xué)合成抗氧化劑BHA、TBHQ對賴氨酸-葡萄糖生成羧甲基賴氨酸具有促進(jìn)作用，BHA促進(jìn)作用較小、TBHQ促進(jìn)作用較大。有的抗氧化劑具有抑制羧甲基賴氨酸的生成作用，而有的卻沒有，有的甚至還具有促進(jìn)生成作用，其原因有待進(jìn)一步探明。