李 浩，胡志剛，陳 強(qiáng)，張慧林，劉小林*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊陵 712100；2.陜西省潼關(guān)安大番鴨育種場(chǎng)，陜西潼關(guān) 714300）

番鴨具有生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高等眾多優(yōu)良品質(zhì)，是十分優(yōu)秀的肉鴨育種素材[1-2]，但其肉質(zhì)極其粗糙，因此番鴨育種的目標(biāo)是盡可能地改善肌肉嫩度。肉質(zhì)嫩化受多種因素影響，是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，其中關(guān)鍵肌原纖維蛋白的降解和肌纖維類型的轉(zhuǎn)化發(fā)揮著舉足輕重的作用[3-5]。CAPNs（鈣蛋白酶，Calpains）是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白酶家族，CAPN1（鈣蛋白酶1，Calpains 1）是該家族的重要成員之一[6-7]。大量研究表明CAPN1基因在肌肉嫩化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-11]。此外，有研究表明CAPN1基因的多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量密切相關(guān)[8-9]。Cafe等[10]證明了牛CAPN1基因的多態(tài)性與肌肉嫩度密切相關(guān)。Kubota等[11]研究發(fā)現(xiàn)CAPN1基因與家雞的體重、肌纖維直徑、嘌呤含量等顯著相關(guān)。綜上，CAPN1基因在肌肉發(fā)育、嫩度調(diào)控以及肉的風(fēng)味改善中發(fā)揮著重要作用，但國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有關(guān)于CAPN1基因在番鴨中的研究。本實(shí)驗(yàn)以黑羽番鴨為研究對(duì)象，對(duì)其CAPN1基因的編碼區(qū)序列進(jìn)行克??；之后采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析，并對(duì)其蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、信號(hào)肽剪切位點(diǎn)、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、修飾位點(diǎn)及空間結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為進(jìn)一步研究CAPN1基因功能和選育黑羽番鴨新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本實(shí)驗(yàn)所用黑羽番鴨（黑番鴨）來(lái)自陜西潼關(guān)安大番鴨育種廠，選取1周齡黑番鴨，取指甲蓋大小的腿肌。采集的組織樣品在液氮中速凍，之后保存于-80℃冰箱中備用。

實(shí)驗(yàn)試劑：DEPC水（Biotopped，China），75%乙醇（用RNase-free ddH2O配置），inNova Uscript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix （AR121，innova gene），Q5 High-Fidelity DNA聚合酶（M0491，NEB），pMD18-T Vector Cloning Kit （NO.6011，TaKaRa），T4 DNA連接酶（EL0014，Thermo），E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞（CW0808S，CWBIO），氨芐青霉素（A6140，Sigma），LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基，DL2000 DNA Marker（TSJ011-100,，TsingKe），DL5000 DNA Marker（TSJ012-100，TsingKe），SoSoo Cloning Kit（TSV-S1，TsingKe），Endo-free Plasmid DNA Mini Kit II（D6950-01，OMEGA），Gel Extraction Kit（D2500-01，OMEGA），TRIzol reagent（DP424,TIANGEN）、氯仿（500 mL，TIANGEN），異丙醇（500 mL，TIANGEN）。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參考NCBI中收錄的家鴨CAPN1基因的mRNA序列（XM_027447352.1），使用Primer Premier 5.0軟件，參照PCR引物設(shè)計(jì)原則，利用同源重組原理將CAPN1基因的CDS序列分為CAPN1-a和CAPN1-b 2個(gè)片段分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，由北京擎科生物公司進(jìn)行合成。再設(shè)計(jì)菌液PCR引物（CAPN1-517），擴(kuò)增大小為517 bp的片段，進(jìn)行陽(yáng)性克隆初步篩選。

1.3 RNA提取及檢測(cè) 在RNA提取前1 d，將剪刀、鑷子、研缽、研杵等器械全部清洗后，用DEPC水浸泡12 h，高壓滅菌，之后放入烘箱中100℃烘烤8 h，待使用時(shí)用液氮預(yù)冷。所用到的各類試劑、槍頭、離心管均要求無(wú)菌無(wú)酶。組織RNA提取采用Trizol法，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。提取的RNA用1% 的瓊脂糖凝膠電泳快速檢測(cè)RNA的質(zhì)量，并用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，選取A260/A280值在1.8～2.0范圍內(nèi)且電泳帶型完整的RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，以適量RNA為模板、Oligo（dT）18為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。

1.5 PCR擴(kuò)增 以黑番鴨腿肌總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用Q5高保真酶對(duì)CAPN1基因編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：cDNA模板（200 ng/μL）1.0 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各2.5 μL，Q5高保真酶（NEB）0.5 μL，5×high GC enhancer 0.5 μL，10Mm dNTPs 1.0 μL，5×Q5 Reaction Buffer 10 μL，加Rnase free ddH2O補(bǔ)足50 uL。PCR設(shè)定程序：98℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（98℃變性30 s，62℃退火10 s，72℃延伸45 s），72℃后延伸2 min，最后4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切取目的條帶，按照膠回收試劑盒說(shuō)明書對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

1.6 重組、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆鑒定 采用SoSoo重組克隆試劑盒，將純化后的PCR產(chǎn)物（CAPN1-a、CAPN1-b）與pMD18-T載體連接，連接體系為10 μL：Linearlized pMD18-T Vector（50 ng/uL，0.03 pmol）1.0 μL，CAPN1-a（0.1～0.3 pmol）1.0 μL，CAPN1-b （0.1～0.3 pmol）1.0 μL，2× SoSoo Mix 5.0 μL，加水補(bǔ)足至10 μL。

加入相關(guān)組分后，用移液器輕輕吹打混勻，低速瞬時(shí)離心所有液體至離心管底部，50℃反應(yīng)15 min。然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng) 12 h。隨機(jī)挑取單克隆，用菌液PCR法和酶切質(zhì)粒法篩選陽(yáng)性克隆，將挑選的陽(yáng)性克隆送北京擎科生物公司測(cè)序。

1.7 序列分析 對(duì)測(cè)序得到的序列使用DNAStar中的SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接；使用NCBI中的ORF Finder工具查找開放閱讀框；使用BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)；使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用ExPASy ProtParam工具分析CAPN1蛋白的理化性質(zhì)；使用ExPASy ProtScale工具分析CAPN1蛋白的親疏水性；使用TEMpred工具對(duì)CAPN1蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行分析；使用SignalP-4.0工具預(yù)測(cè)信號(hào)肽；使用TargetP 1.1 Server工具預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；使用NetPhos 3.1 Server工具預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)；使用NetOGlyc 4.0 Server工具預(yù)測(cè)O-糖基化位點(diǎn)；使用NetNGlyc 4.0 Server工具預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)；使用SOPMA工具分析CAPN1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用NCBI的CDD工具預(yù)測(cè)CAPN1蛋白的結(jié)構(gòu)域；使用SWISS-MODEL工具預(yù)測(cè)CAPN1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 黑番鴨CAPN1基因CDS區(qū)克隆

2.1.1 PCR擴(kuò)增 由圖1可知，成功獲得大小為1 103 bp和1 068 bp條帶，目的條帶清晰，無(wú)雜帶，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 陽(yáng)性克隆鑒定 菌液PCR檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，有2個(gè)菌落鑒定結(jié)果為陽(yáng)性。

將這2個(gè)菌落分別加入到5 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)12 h，用于提質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，1號(hào)和2號(hào)質(zhì)粒經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，均形成了2 692 bp和2 148 bp 2個(gè)片段，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。將菌液PCR鑒定和質(zhì)粒酶切鑒定均為陽(yáng)性的克隆，送北京擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 序列拼接及ORF查找 對(duì)測(cè)序得到的序列使用DNAStar中的SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接，拼接后得到一段長(zhǎng)度為2 148 bp的序列。使用NCBI中的ORF Finder工具查找序列的開放閱讀框，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAPN1基因含有一個(gè)長(zhǎng)度為2 148 bp的開放閱讀框，編碼715個(gè)氨基酸（圖4），將序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)為：MT419750.1。

2.2.2 同源性比對(duì) 同源性比對(duì)結(jié)果如表2所示，黑番鴨CAPN1基因核苷酸序列與鴨（Anas platyrhynchos）、雞（Gallus gallus）、雉雞（Phasianus colchicus）、人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）、馬（Equus caballus）的同源性分別為98.70%、87.29%、86.11%、81.89%、81.62%、81.18%、81.04%、81.27%；黑番鴨CAPN1基因氨基酸序列與鴨（Anas platyrhynchos）、雞（Gallus gallus）、雉雞（Phasianus colchicus）、人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）、馬（Equus caballus）的同源性分別為99.30%、91.47%、90.63%、83.22%、83.64%、83.10%、82.96%、83.36%（表3）。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 通過(guò)NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索并下載另外8個(gè)物種的CAPN1基因編碼區(qū)（CDS）序列，連同測(cè)序得到的黑番鴨CAPN1基因編碼區(qū)序列，使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用ML（最大似然法）建樹，替換模型選擇Tamura 3-parameter，替換速率服從Gamma分布，結(jié)果如圖5所示，番鴨先與家鴨聚在一起，之后再與雞、雉雞聚在一起，最后與牛、羊聚在一起。

表2 黑番鴨CAPN1 基因核苷酸序列與其他物種的同源性比對(duì)

表3 黑番鴨CAPN1 基因氨基酸序列與其他物種的同源性比對(duì)

2.2.4 理化性質(zhì)分析 由理化性質(zhì)分析結(jié)果可知，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，黑番鴨CAPN1蛋白是線粒體靶向肽（mitochondrial targeting peptide，mTP）和分泌通路信號(hào)肽（secretory pathway signal peptide，SP）的概率分別是10%和12.7%，說(shuō)明CAPN1蛋白無(wú)信號(hào)肽，不是分泌蛋白。CAPN1蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)中的可能性為56.5%，分布于細(xì)胞核中的可能性為17.4%，分布于線粒體中的可能性為26.1%，預(yù)測(cè)可信度為94.1%，所以，CAPN1蛋白可能主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2.8 修飾結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 對(duì)黑番鴨CAPN1蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，只有當(dāng)氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸且閾值高于0.5時(shí)，才認(rèn)為其是潛在的磷酸化位點(diǎn)，可知黑番鴨CAPN1蛋白共存在59個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括29個(gè)絲氨酸、8個(gè)酪氨酸、22個(gè)蘇氨酸。

對(duì)黑番鴨CAPN1蛋白可能的N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)黑番鴨CAPN1蛋白共有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別位于第127、310、469位氨基酸處。

對(duì)黑番鴨CAPN1蛋白可能的O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)黑番鴨CAPN1蛋白共有9個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)，分別位于第12、15、66、67、77、80、89、379、532位氨基酸處。

2.2.9 結(jié)構(gòu)分析 CAPN1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖8所示，α-螺旋（Alpha helix，Hh）有301個(gè)氨基酸，占42.10%；β-轉(zhuǎn)角（Beta turn，Tt）有52個(gè)氨基酸，占7.27%；延伸鏈（Extended strand，Ee）有115個(gè)氨基酸，占16.08%；無(wú)規(guī)卷曲（Random coli，Cc）有247個(gè)氨基酸，占34.55%；以上4種結(jié)構(gòu)貫穿于整個(gè)氨基酸鏈，但α-螺旋占比最高，β-轉(zhuǎn)角占比最低。

對(duì)番鴨CAPN1蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖9所示，CAPN1蛋白包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為鈣蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域（Calpain catalytic domain，Peptidase_C2）、鈣蛋白酶亞結(jié)構(gòu)域III（Calpain subdomain III，Calpain_III）、鈣調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域（Calpain domain，EFh_PEF_CAPN1）。

對(duì)黑番鴨CAPN1蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，選擇人m-Calpain II型晶體結(jié)構(gòu)（SMTL ID：1kfu.1.A）為模板，該模板與目的蛋白序列的一致度為63.18%，可以用做CAPN1蛋白三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖10所示。

3 討論

肌肉嫩度是非常重要的肉質(zhì)性狀，肌原纖維結(jié)構(gòu)、肌肉細(xì)胞完整性、蛋白分解酶活性，甚至是屠宰前、屠宰后的不同時(shí)間階段等因素都會(huì)影響肌肉嫩度[4]。這些因素中關(guān)鍵肌原纖維蛋白的降解發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]。CAPN1基因是一種細(xì)胞內(nèi)鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白酶，可以作用于肌原纖維以調(diào)控肌肉嫩度[13]。最初，CAPN1基因在肌肉蛋白降解過(guò)程中的作用在小鼠中被發(fā)現(xiàn)[14]。Geesink等[14]研究表明CAPN1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的蛋白積累能力。此后，Oliver等[15]再次驗(yàn)證了敲除CAPN1基因的小鼠在30周齡時(shí)，蛋白質(zhì)積累能力顯著高于對(duì)照組。Cheong等[16]研究發(fā)現(xiàn)CAPN1基因的3'UTR區(qū)域與肌肉大理石紋密切相關(guān)；Casas[17]等發(fā)現(xiàn)CAPN1基因會(huì)影響肉的風(fēng)味；Xin等[18]證實(shí)了CAPN1基因與肌肉的pH、脂肪酸和氨基酸含量有關(guān)。CAPN1基因還被證實(shí)通過(guò)修改靶蛋白的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)特征從而參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架調(diào)控等重要過(guò)程[19]。目前，對(duì)于CAPN1基因的克隆在家豬[20]、雞[21]、牛[22-23]、山羊[24]等物種中已有報(bào)道，但是尚沒(méi)有關(guān)于番鴨CAPN1基因的研究。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了黑番鴨CAPN1基因的編碼區(qū)序列。該序列包含一個(gè)2 148 bp的完整開放閱讀框，共編碼715個(gè)氨基酸，這與趙婧微[25]等克隆廣靈驢CAPN1基因的結(jié)果一致。此外，已有研究結(jié)果表明牦牛[22-23]和山羊[24]的CAPN1基因編碼區(qū)長(zhǎng)均為2 151 bp，共編碼716個(gè)氨基酸，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相近；四川山地烏骨雞的CAPN1基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為2 115 bp，編碼705個(gè)氨基酸[21]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有較大差距。這些物種在核苷酸序列和氨基酸序列組成上的差異在一定程度上說(shuō)明了親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。理化性質(zhì)分析和親疏水性分析均表明CAPN1蛋白是親水性蛋白。這與家豬[20]、雞[21]、牛[22-23]、山羊[24]、廣靈驢[25]、鯉[26]等動(dòng)物中的研究結(jié)果一致，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。信號(hào)肽是分泌蛋白特有的結(jié)構(gòu)，極少超過(guò)45個(gè)氨基酸殘基[27-28]。所以本實(shí)驗(yàn)只分析CAPN1蛋白N端70個(gè)氨基酸，結(jié)果表明番鴨CAPN1蛋白無(wú)信號(hào)肽，不是分泌蛋白，并且主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。這些結(jié)果同已報(bào)道的家豬[20]、雞[21]、牛[22-23]、山羊[24]等動(dòng)物CAPN1蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果完全一致。磷酸化和糖基化都是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用[29-32]。本實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)黑番鴨CAPN1蛋白存在3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。但是根據(jù)信號(hào)肽分析結(jié)果可知，CAPN1蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，所以不太可能暴露于N-糖基化機(jī)制，因此即使它們含有潛在的N-糖基化基序，在體內(nèi)也可能不能被糖基化。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈中形成的有規(guī)則重復(fù)的結(jié)構(gòu)[34-35]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黑番鴨CAPN1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果與廣靈驢[25]中的研究結(jié)果相近，但與鯉[26]的研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)榉喤c廣靈驢在親緣關(guān)系上較近，與鯉在親緣關(guān)系上比較遠(yuǎn)。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)黑番鴨CAPN1蛋白包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中鈣蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域包含催化位點(diǎn)，屬于CysPc超家族，位于第56～352位氨基酸處；鈣調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域包含Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，屬于EFh_PEF超家族，位于第547～715位氨基酸處；鈣蛋白酶亞結(jié)構(gòu)域III屬于Calpain_III超家族，位于第373～520位氨基酸處，有酸性環(huán)，將催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域連接起來(lái)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了黑番鴨CAPN1基因CDS序列，得到一個(gè)長(zhǎng)度為2 148 bp的片段，編碼715個(gè)氨基酸，將序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)為MT419750.1。生物信息學(xué)分析確定CAPN1蛋白是親水性蛋白，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，不是分泌蛋白，無(wú)信號(hào)肽，有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和4種二級(jí)結(jié)構(gòu)。CAPN1蛋白雖有潛在的N-糖基化序列，但不能發(fā)生N-糖基化修飾。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論為進(jìn)一步研究CAPN1基因功能和選育黑羽番鴨新品種提供理論依據(jù)。