王翌，李淼，李永鋒，孫元，仇華吉

野豬糞便中乳酸菌的分離鑒定及特性研究

王翌，李淼，李永鋒，孫元，仇華吉

（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150069）

【】篩選安全的、具有優(yōu)良特性的乳酸菌菌株，進一步研發(fā)益生制劑，為飼料添加劑等動物相關產品提供資源。從我國黑龍江省大興安嶺地區(qū)采集野豬糞便樣品13份，編號后置于4℃保溫箱迅速運回實驗室，利用MRS培養(yǎng)基分離純化乳酸菌。使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR鑒定，將擴增得到的序列測序后在NCBI上使用BLAST與GenBank數(shù)據庫中序列進行對比分析，確定各菌株的分類學地位。將鑒定后的乳酸菌菌株分別接種于酸性（pH 3.0）和含膽鹽（0.3%）的MRS培養(yǎng)基，在不同條件下評價乳酸菌菌株的耐酸、耐膽鹽特性。將過夜培養(yǎng)的乳酸菌于室溫條件下靜置，在不同時間測定其OD600nm，進行自凝集能力評價；過夜培養(yǎng)的菌株分別與致病性埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌3種致病菌混合后于室溫靜置，進行共凝集能力檢測。在體外，分別進行乳酸菌菌株對Caco-2細胞和IPEC-J2細胞的黏附能力測定，評價不同菌株的黏附能力。通過測定乳酸菌菌株對致病性埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌3種致病菌的抑菌環(huán)直徑，評價分離菌株的抑菌活性。通過體內外試驗評價乳酸菌菌株的安全性。在體外，分別以模式菌株嗜酸乳桿菌和金黃色葡萄球菌作為陰性對照和陽性對照，將3株乳酸菌菌株和對照菌株在血平板上劃線，37℃厭氧孵育18—24 h，觀察細菌菌落周圍是否形成溶菌環(huán)，評價分離菌株的溶血特性。使用文獻中已報道的毒力因子引物對分離的乳酸菌菌株進行PCR擴增，檢測是否存在毒力因子的編碼基因，評估分離菌株的安全性。在體內，將過夜培養(yǎng)的乳酸菌連續(xù)飼喂7周齡的BALB/c小鼠21 d，分別測定小鼠的初始體重和最終體重，觀察計算體重變化情況；飼喂21 d后，解剖獲取小鼠的脾臟、肝臟和腎臟計算器官指數(shù)，評價分離乳酸菌菌株的體內安全性。從野豬糞便中分離得到3株對酸和膽鹽具備一定耐受力的乳酸菌，經鑒定分別為蒙氏腸球菌（）、耐久腸球菌（）和黏膜乳桿菌（）。3株乳酸菌菌株均表現(xiàn)出較強的自凝集能力和對致病菌的共凝集能力，同時對Caco-2細胞和IPEC-J2細胞均表現(xiàn)出較強的黏附能力，抑菌試驗結果顯示黏膜乳桿菌對3種致病菌均具備較強的抑菌活性。經體內外安全性評價，3株乳酸菌菌株無溶血性，且均未檢測到毒力基因，經其連續(xù)飼喂的小鼠行為表現(xiàn)正常、狀態(tài)良好，其中，與對照組相比，黏膜乳桿菌飼喂后小鼠增重顯著。從大興安嶺野豬糞便中分離的3株乳酸菌（特別是黏膜乳桿菌）具有良好的特性和安全性，具備進一步開發(fā)益生菌制劑的潛力。

野豬；乳酸菌；凝集能力；黏附能力；安全性

0 引言

【研究意義】當前，抗生素作為飼料添加劑廣泛用于促進動物生長及疾病預防，而動物相關產品及制品中抗生素殘留以及細菌耐藥性問題日趨嚴峻并亟需解決[1]。因此，抗生素替代品的開發(fā)備受關注。益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，不存在耐藥性或殘留的問題。在眾多的益生菌產品中，最為常見的是乳酸菌，它能夠利用碳水化合物發(fā)酵產生乳酸，是人體和哺乳動物腸道微生物的主要組成部分，對宿主的健康有著重要的促進作用，國家食品藥品監(jiān)督局將其評定為食品安全級的菌株[2]?！厩叭搜芯窟M展】乳酸菌具有廣泛的益生作用，例如改善消化功能，增強機體免疫水平，緩解炎癥性腸病和便秘，增強黏膜屏障作用等。乳酸菌作為益生菌不但有利于宿主的健康，一些乳酸菌分離株甚至具有抗癌或治療糖尿病的效用[3-7]。為了發(fā)揮良好的益生效果，乳酸菌在胃腸道的轉運過程中必須保持高水平的存活效率和定植能力[8]。因此，乳酸菌對酸性環(huán)境的抵抗力、對膽鹽的適應濃度以及對腸上皮細胞的黏附特性等是評價其免疫調節(jié)功能的重要指標。【本研究切入點】目前，從乳制品、泡菜等食品和禽類、魚等動物體內分離益生菌的研究較多，而對于從野豬中分離益生菌的研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以大興安嶺野豬糞便中的乳酸菌株為研究對象，對其進行分離與鑒定，進一步評價了其對pH和膽鹽的耐受能力、黏附能力、凝集能力和抑菌特性，同時評估了其安全性，以期篩選出安全且具有良好特性的乳酸菌，為進一步應用于飼料添加劑等動物相關產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 樣品來源 2018年6月從黑龍江大興安嶺地區(qū)采集野豬糞便樣品13份，用無菌棉簽小心地撥開糞便，再用新的無菌棉簽從糞便內部輕輕蘸取少許，收集于50 mL無菌離心管，編號后置于4℃保溫箱迅速運回實驗室。

1.1.2 菌株、細胞和試驗動物 標準致病菌株主要用于抑菌試驗和共凝集試驗，包括致病性埃希氏大腸桿菌（BNCC 337304）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538P）及鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）。模式菌株嗜酸乳桿菌（ATCC 4356）用于比較乳酸菌菌株的黏附能力和溶血性分析。結腸腺癌細胞Caco-2（BNCC 338148）使用含20%血清的MEM培養(yǎng)基，豬小腸上皮細胞IPEC-J2（BNCC 338252）使用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，用于乳酸菌黏附試驗。以上菌株及細胞均由獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室保存。20只7周齡的雌性BALB/c小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司，用于乳酸菌的體內安全性評價。

1.1.3 主要試劑 MRS培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）購自哈爾濱寶士德生物科技有限公司。MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）及0.25%胰酶購自Gibco公司。

1.2 乳酸菌的分離與鑒定

從大興安嶺采集野豬糞便，每管糞便樣本中加入約5倍體積的MRS培養(yǎng)基，充分振蕩混勻，分別取1 mL轉接至8 mL MRS培養(yǎng)基中，于37℃溫箱厭氧培養(yǎng)24 h，分別取微量過夜培養(yǎng)的菌液，在MRS固體培養(yǎng)基上進行劃線，置于37℃溫箱中厭氧培養(yǎng)24 h。挑取特征明顯的菌落反復劃線分離，直至分離出形態(tài)、大小一致的菌落，進行革蘭氏染色。對菌體形態(tài)進行顯微觀察，確定為單一的革蘭氏陽性菌后，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA。利用細菌16S rDNA通用引物進行擴增（表1），PCR反應程序為：95℃5 min；95℃ 45 s，50℃ 1 min，72℃ 90 s，共10個循環(huán)；95℃ 45 s，58℃ 1 min和72℃ 90 s，共15個循環(huán)；95℃ 45 s，55℃ 1 min和72℃ 90 s，共10個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增片段測序后，使用BLAST與GenBank數(shù)據庫中序列進行對比分析。

將分離的乳酸菌在酸性（pH 3.0）和膽鹽（0.3%）條件下評價其耐受性[9]，將過夜培養(yǎng)的菌液接種于5 mL pH 3.0的MRS和含0.3%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃孵育4 h，測定其OD600nm值，篩選出具備較強耐酸、耐膽鹽特性的菌株用于后續(xù)試驗。

1.3 乳酸菌的自凝集能力測定

按照Collado等[10]的方法稍作改進后進行乳酸菌的自凝集能力檢測：將分離的乳酸菌轉接于5 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃溫箱中靜置培養(yǎng)18 h。以5 000×離心10 min收集菌體，PBS洗滌2次后將其重懸于2 mL PBS中，調節(jié)OD600nm為0.25 ± 0.05，室溫條件下靜置，在不同時間點（0、2、4、6、10和24 h）分別取100 μL上層懸液測定其OD600nm。乳酸菌的自凝集率AA（%）計算公式如下：AA（%）= [(A0? At)/A0]×100。其中，A0是0 h測定的乳酸菌懸液OD600nm值；At是靜置后不同時間點測定的OD600nm值。

1.4 乳酸菌與致病菌的共凝集能力測定

對乳酸菌進行共凝集能力檢測，方法如下[11]：取乳酸菌懸液2 mL（OD600nm= 0.25 ± 0.05）分別與3株標準致病菌株等體積混合，室溫靜置，在不同時間點（0、2、4、6、10和24 h）分別取100 μL上層懸液測定其OD600nm。根據如下公式計算乳酸菌與致病菌的共凝集率AC（%）：AC（%）= [(Apro+Apat)-Amix]/ (Apro+Apat)×100。其中，Apro+Apat代表0 h混合懸液的OD600nm值；Amix是不同時間點測定的OD600nm值。

1.5 乳酸菌的黏附能力測定

將Caco-2細胞和IPEC-J2細胞分別接種于24孔板，待其貼壁生長至80%—90%時進行黏附試驗。將過夜培養(yǎng)的乳酸菌以5 000×離心10 min收集菌體，PBS洗滌2次，將其以108CFU/mL重懸于PBS（含100 μg·mL-1FITC）中，37℃避光孵育1 h將細菌著色，隨后PBS洗滌3次除去未結合的FITC，重懸于PBS中。用PBS將細胞洗滌3次，每孔加入500 μL FITC標記的菌懸液，使用多功能酶標儀測定其初始熒光強度（吸收光波長為485 nm，發(fā)射光波長為530 nm），將24孔板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h。PBS洗滌24孔板3次，去除未黏附的乳酸菌，加入100 μL 0.25%的胰酶作用10 min后，再加入400 μL含20% FBS的培養(yǎng)基終止反應，使用酶標儀測定其熒光強度[12]。按照如下公式計算：黏附率（%）= C/C0×100。其中，C0代表乳酸菌黏附前的熒光強度，C代表乳酸菌黏附后的熒光強度。

1.6 乳酸菌的抑菌能力測定

按照Bhola等[13]的方法進行乳酸菌的抑菌能力測定。先將滅菌的牛津杯平放在底層MRS固體培養(yǎng)基上，將指示菌按1%接種于45—50℃的MRS固體培養(yǎng)基中，混勻后倒入放置好牛津杯的培養(yǎng)皿中，待其凝固后取出牛津杯，在杯孔中加入過夜培養(yǎng)的待測乳酸菌培養(yǎng)液，每孔100 μL，37℃溫箱培養(yǎng)24 h后，使用游標卡尺測量抑菌環(huán)大小。

1.7 乳酸菌的安全性評價

將過夜培養(yǎng)的模式菌株嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌和3株乳酸菌菌株在血平板上劃線，37℃厭氧孵育18—24 h，觀察細菌菌落周圍是否形成溶菌環(huán)。根據文獻中已報道的毒力因子基因在NCBI上查找相關序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行基因合成，同時設計相應引物（表1），以合成基因作為陽性對照，對分離菌株進行PCR擴增，檢測是否存在毒力因子的編碼基因，進行分離菌株的體外安全性評價[14-18]。

表1 PCR擴增引物

過夜培養(yǎng)的M6-5、M2-38和M6-27菌株以5 000×離心10 min收集菌體，將其以1010CFU/mL重懸于PBS。7周齡的BALB/c小鼠隨機分為4組，每組5只，分別將上述3種細菌懸液和PBS連續(xù)飼喂21 d，100 μL·d-1。測定小鼠的初始體重以及飼喂7、14和21 d的體重，計算體重變化情況；連續(xù)飼喂結束后，解剖獲取小鼠的脾臟、肝臟和腎臟按照如下公式計算器官指數(shù)：器官指數(shù)=器官重量/小鼠體重，對乳酸菌菌株進行體內安全性評價[19]。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22統(tǒng)計軟件分析試驗數(shù)據，<0.05表示差異顯著，所有試驗設置3個重復，數(shù)值以平均數(shù)±標準差表示。

2 結果

2.1 乳酸菌分離株的分類

從野豬糞便樣品中分離的細菌通過在MRS固體培養(yǎng)基反復純化后，經革蘭氏染色證明分離的菌株均為的革蘭氏陽性菌（結果未顯示）。耐酸、耐膽鹽試驗結果顯示，其中有3株乳酸菌顯示出一定程度的耐受性，在酸性和含膽鹽的MRS培養(yǎng)基中存活率能達到50%—80%以上不等，其中M6-27菌株具備最為優(yōu)良的耐酸、耐膽鹽特性，在pH 3.0時存活率高達70.47%，膽鹽濃度0.3%時存活率達80%以上。經16S rDNA鑒定，此3株乳菌分別為蒙氏腸球菌（M6-5）、耐久腸球菌（M2-38）和黏膜乳桿菌（M6-27）（表2）。

2.2 乳酸菌的自凝集能力與致病菌的共凝集能力

對分離的3株乳酸菌進行自凝集能力檢測，結果如圖1所示，隨著時間的推移，3株乳酸菌的自凝集率穩(wěn)步上升，其中，M6-27和M2-38菌株具有較強的自凝集能力，靜置24 h后其自凝集率高達70%以上，明顯高于M6-5菌株，而M6-5在靜置24 h后凝集率也達到了50%（圖1-A）。

表2 三株乳酸菌的種屬鑒定及耐酸、耐膽鹽特性

A：3株乳酸菌自凝集能力；B-D：3株乳酸菌與致病性埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及鼠傷寒沙門氏菌共凝集能力

共凝集能力檢測結果顯示，分離的乳酸菌菌株均能凝集致病性埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌3種致病菌。其中M2-38凝集致病性埃希氏大腸桿菌能力最強，可達到70%以上（圖1-B）。3株乳酸菌凝集金黃色葡萄球菌的能力接近，凝集率均在50%左右（圖1-C）。3株乳酸菌凝集鼠傷寒沙門氏菌的能力有所不同，其中M6-27凝集能力最強，可達60%；M2-38次之，凝集率接近50%；M6-5凝集能力最弱，只有不到40%（圖1-D）。

2.3 乳酸菌的黏附能力

黏附試驗結果顯示，3株乳酸菌菌株對Caco-2細胞的黏附率均達到50%以上，其中，M6-27菌株黏附率最高，可達72%，顯著高于模式菌株ATCC 4356（<0.05）；另外，2株M2-38和M6-5菌株黏附率分別為63%和56%，其中M2-38也顯著高于ATCC 4356菌株（<0.05）（圖2-A），結果表明，2株乳酸菌菌株M6-27和M2-38均具有較強的黏附能力。圖2-B顯示，3株乳酸菌菌株對IPEC-J2細胞的黏附能力極顯著高于參考菌株（<0.001），其中乳酸菌菌株M6-27的黏附能力最高，可達77%。

2.4 乳酸菌的抑菌能力

乳酸菌體外抑菌試驗結果顯示，3株乳酸菌均對鼠傷寒沙門氏菌有抑制作用，其中M6-27菌株抑菌能力最強，抑菌環(huán)直徑為（13.61 ± 0.27）mm；M6-5和M6-27菌株對致病性埃希氏大腸桿菌有抑制作用，而只有M6-27菌株對金黃色葡萄球菌有抑制作用（表3）。以上結果表明，本研究篩選的3株乳酸菌抑菌能力不盡相同，M6-27菌株對3種致病菌均具有較強的抑菌活性。

2.5 乳酸菌的安全性

溶血性試驗結果顯示，金黃色葡萄球菌（ATCC 6538P）劃線的血平板上菌落周圍形成完全透明的溶血環(huán)（β型溶血），模式菌株嗜酸乳桿菌（ATCC 4356）和3株乳酸菌菌株劃線的血平板上菌落周圍無溶血現(xiàn)象，表明3株乳酸菌均無溶血性（圖3）。食物來源的腸球菌存在單一或多重毒力因子，盡管其在益生性腸球菌中的發(fā)生率較低，另外，也有關于乳桿菌中存在毒力因子的報導，因此仍需對本試驗中分離的兩株腸球菌和一株黏膜乳桿菌進行毒力因子的分析，以評估其安全性。在本研究中，以乳酸菌分離株基因組DNA為模板，使用多對毒力因子相應引物進行PCR擴增，均未檢測到毒力因子（圖4）。

NS: not significant; *:<0.05; ***:<0.001

A：3株乳酸菌對Caco-2的黏附能力；B：3株乳酸菌對IPEC-J2的黏附能力

A: Adhesion ability of the three strains of lactic acid bacteria to Caco-2 cells；B: Adhesion ability of the three strains of lactic acid bacteria to IPEC-J2 cells

圖2 3株乳酸菌黏附能力

Fig. 2 The adhesion ability of three lactic acid bacteria

表3 3株乳酸菌對致病菌的抑制能力

—表示乳酸菌株對致病菌未產生抑制作用Indicated there is no inhibition activity of LAB against pathogenic bacteria

A：M2-38；B：M6-5；C：M6-27；D：陰性對照：嗜酸乳桿菌（ATCC 4356）；E：陽性對照：金黃色葡萄球菌（ATCC 6538P）

M：DL2000 Marker；1-3、6-8、11-13和16-18：擴增gelE、ebp、espA、agg基因片段；4、9、14和19：陽性對照；5、10、15和20：陰性對照

與對照組相比，連續(xù)飼喂乳酸菌菌株的各組小鼠在第7、14天的體重增加比例無顯著性差異（結果未顯示）。在第21天，黏膜乳桿菌M6-27飼喂小鼠的體重增加百分率與對照組相比差異極顯著（<0.01）（圖5-A）。此外，小鼠脾臟（圖5-B）、肝臟（圖5-C）和腎臟（圖5-D）的器官指數(shù)在各小組間無顯著差異。

NS: not significant; **:<0.01

A：3株乳酸菌對小鼠體重的影響；B-D：三株乳酸菌對小鼠脾臟、肝臟、腎臟指數(shù)的影響

A: Effect of probiotic supplementation on body weight gain of mice; B-D: The indices analysis of spleen, liver, and kidney in all the experimental groups

圖5 乳酸菌在小鼠體內的安全性評價

Fig. 5 Safety evaluation of lactic acid bacteria in mice

3 討論

野豬，也稱“山豬”，屬于偶蹄目豬科豬屬。與家豬相比，野豬體軀健碩、野性兇猛、抗逆性強。野豬為雜食性動物，主要以植物、種子、菌類、果實、昆蟲及小型脊椎動物為食，其飲食習慣、活動模式等也與統(tǒng)一化飼喂的家豬不同，因此，長期的進化導致二者腸道正常菌群組成也不盡相同。目前，關于家豬體內益生菌分離鑒定的報導較為常見，而少有研究從野豬體內進行益生菌的分離，因此本研究選擇對野豬糞便樣本進行采集與益生菌的分離鑒定。大興安嶺地區(qū)位于黑龍江省西北部、內蒙古自治區(qū)東北部、大興安嶺山脈東北坡，是中國最北端的地級行政區(qū)，土地面積占全省51.8%，地廣人稀，是黑龍江野生動物的主要活動基地[20]。大興安嶺地區(qū)野豬資源豐富，野豬生長活動于此，人為污染少，常見病原感染少，有望能夠分離出天然、具備優(yōu)良特性的益生菌株。

益生菌在改善腸道功能和提高動物生產性能等方面發(fā)揮著重要作用。乳酸菌作為最為常見的益生菌，可以通過平衡腸道菌群維持宿主的腸道健康，甚至治療人類和動物的腸道疾病[21]。同時，研究證實，益生菌作為飼料添加劑對不同生長期豬都能產生積極作用，比如改善動物健康和性能[22]。

為了獲得具有優(yōu)良特性的乳酸菌株，必須對其基本功能特性和安全性進行評價。因為胃中的酸性條件和十二指腸的膽鹽是益生菌在胃腸道生存的最大障礙，所以在胃腸道定植的首要條件是擁有對低pH和膽鹽的抵抗力[23-24]。不同菌株在酸性和膽鹽條件下的存活率不同，可能是由于其對酸性和膽鹽的耐受性機制不同所致[25]。在本研究中，我們篩選了3株不同的乳酸菌株，均具有較強的耐酸、耐膽鹽能力。

黏附是乳酸菌有效地定植于腸上皮細胞表面、發(fā)揮益生作用的前提條件，因此黏附能力是評價益生菌的一個非常重要的指標[25-26]。益生菌的自凝集和共凝集能力在防止病原體表面定植方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，聚集的益生菌能夠形成覆蓋腸道黏膜表面的物理屏障，防止病原體的定植，而益生菌與致病菌結合是宿主抵御感染的重要防御機制[27-29]。本研究中分離的乳酸菌株中，M6-27菌株具有較強的自凝集和共凝集致病菌的能力，同時可以抑制3種致病菌的活性。

通過比較分析3株乳酸菌的凝集能力、黏附特性和抗菌特性發(fā)現(xiàn)，每株益生菌各有特點，這可能與其生活環(huán)境、產生不同的副產物、生物特性以及其他因素等有關，但綜合看來，M6-27各方面特性均較為優(yōu)良。已有研究表明，部分益生菌株可能具有抗病毒和抗癌活性[30-31]。因此，深入探索3株益生菌的抗癌和抗病毒活性具有重要意義。

乳酸菌在乳制品、肉制品、泡菜和青貯飼料以及益生菌制品發(fā)酵中被廣泛使用，具有悠久的歷史，大部分乳酸菌被公認為安全級。但考慮到本研究中分離乳酸菌的目的是進一步作為飼料添加劑使用，因此，對其可能攜帶的毒力基因進行檢測是十分必要的。在本研究中，分離得到的3株乳酸菌均無溶血性和毒力因子。同時，將乳酸菌連續(xù)飼喂小鼠后，對小鼠健康未產生任何不良影響，而飼喂黏膜乳桿菌（M6-27）的小鼠體重顯著增加，表明這株乳酸菌在一定程度上能夠提高生長性能，有望用于動物飼料添加劑的開發(fā)。

4 結論

從大興安嶺野豬糞便中分離得到3株乳酸菌，經16S rDNA鑒定，此3株乳酸菌分別為蒙氏腸球菌、耐久腸球菌和黏膜乳桿菌，在酸性和含膽鹽培養(yǎng)基中存活能力較強。其中黏膜乳桿菌具備良好的黏附能力和凝集能力，并且能夠抑制3種致病菌的生長，具有較強的抑菌活性，而連續(xù)飼喂21 d黏膜乳桿菌可顯著增加小鼠體重，表明其具備良好的益生特性。后期將對黏膜乳桿菌的免疫調節(jié)活性、體內抑菌能力等進行進一步研究，使其能更好的作為益生制劑應用于飼料添加劑等動物相關產品中。

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Identification and Properties of Lactic Acid Bacteria Isolated from Wild Boar Feces

WANG Yi, LI Miao, LI YongFeng, SUN Yuan, QIU HuaJi

(State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069)

【】In order to screen safe lactic acid bacteria (LAB) strains with probiotic properties, LAB were isolated in this study for further developing probiotics and providing resources for animal related products such as feed additives.【】A total of 13 samples of wild boar feces were collected from Greater Khingan Mountains in China, and the samples were quickly returned to the laboratory at 4°C for isolation and purification of LAB. The genomic DNA of the isolated Gram-positive bacteria was extracted by bacterial genomic DNA extraction kit. After 16s rDNA identification, the sequence was compared with information in GenBank database using BLAST, and the classification status of each strain was determined. The tolerance capacity of LAB was evaluated under acidic pH condition (pH 3.0) and bile salt (0.3%). The LAB was cultured overnight, observed and determined at different time, and then the autoaggregation ability was evaluated. The strains cultured overnight were mixed with,andat room temperature for coaggregation test., the adhesion ability of LAB to Caco-2 cells and IPEC-J2 cells was measured and evaluated. The anti-pathogenic activities were detected by measuring the bacterial inhibition rings on plates of LAB against,, and. Evaluation of the safety of LAB strains byandtests. LAB isolates were cultured in MRS medium for 18–24 h at 37℃. Streak plate methods were performed on sheep blood agar plates to analyze hemolytic activity. The absence/presence of virulence factor genes for the isolated strains was performed using PCR amplification with primers. After 21 days of continuous LAB supplementation, the parameters of general health status including body weight gain and organ index were calculated to assess the safety of the LAB. 【】Three LAB strains isolated from wild boar feces were,, and, with the excellent tolerance to acid and bile salt. The results showed that these three strains showed strong adhesion and aggregation ability, and the antimicrobial effect ofon the three pathogenic bacteria was better than others. The result of safety evaluation demonstrated that these strains were free of hemolytic activity, and no virulence genes could be detected. The percentage of body weight gain of the mice treated withwas significantly higher (<0.01) than that of the control mice on day 21. 【】Taken together, the results indicated that three probiotic strains, especially, had good probiotic properties and safety, so this study provided a scientific basis for further development of probiotic preparations.

wild boar; lactic acid bacteria; aggregation; adhesion ability; safety

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.14.019

2019-08-27；

2020-02-19

國家自然科學基金（31802169）、中國博士后科學基金（2018M641565）

王翌，E-mail：ywwhitewhy@163.com。通信作者孫元，E-mail：sy0604@126.com。通信作者仇華吉，E-mail：qiuhuaji@caas.cn

（責任編輯 林鑒非）