牛皓，平俊愛，王玉斌，張福耀，呂鑫，李慧明，楚建強(qiáng)

基于SSR的光敏型飼草高粱分子輔助育種體系

牛皓1,2，平俊愛1,2，王玉斌1,2，張福耀1,2，呂鑫1,2，李慧明1,2，楚建強(qiáng)1,2

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）高粱研究所/高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西晉中 030600；2農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

【】利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)光敏型飼草高粱新品種傳統(tǒng)選育方法進(jìn)行改良，構(gòu)建分子輔助育種體系，從而提高品種選育效率，降低育種成本，為形成新的育種體系奠定理論基礎(chǔ)。以光敏型（不抽穗）飼草高粱品種晉光1R去雄后為母本、非光敏型（抽穗）飼草高粱BMRC-3-2為父本進(jìn)行雜交，構(gòu)建F2群體。按照光敏與非光敏性狀將群體分為兩類，各選30株，取葉片提取DNA，利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)（SSR）和集團(tuán)分離分析法(BSA)對(duì)晉光1R/BMRC-3-2的F2群體進(jìn)行光敏感基因定位分析，以及特異性SSR引物的設(shè)計(jì)、篩選；將篩出的特異性引物對(duì)F1雜交種（以晉光1R為親本選育的高代穩(wěn)定恢復(fù)系作為父本與其他不育系測(cè)配得到的F1代雜交種）進(jìn)行光敏性鑒定，通過與田間表型對(duì)照，確定最終目標(biāo)引物，從而構(gòu)建新的光敏型飼草高粱新品種選育體系。經(jīng)過SNP index分析，選取99%閾值線最高點(diǎn)前后約250 kb的區(qū)域作為性狀相關(guān)的候選區(qū)域，區(qū)域總長(zhǎng)度為500 kb，共400個(gè)SNP位點(diǎn)，對(duì)這些SNP位點(diǎn)注釋，其中非同義突變或者stop-gain或者stop-loss的SNP位點(diǎn)有6個(gè)，最終確定2個(gè)候選基因與高粱光敏感性相關(guān)，這兩個(gè)基因位于高粱第7染色體。利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)開發(fā)引物51對(duì)，對(duì)光敏和非光敏的親本及F1雜交種進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，選定1對(duì)特異性引物70.2-3，結(jié)果表明，以251 bp處出現(xiàn)“單峰”為判斷依據(jù)，引物70.2-3對(duì)50個(gè)非光敏型F1雜交種的鑒選準(zhǔn)確率達(dá)到100%，所有材料均在251 bp附近出現(xiàn)峰值。以214和251 bp兩處附近出現(xiàn)“雙峰”為判斷依據(jù)，該引物對(duì)另外50個(gè)光敏型F1雜交種鑒選的準(zhǔn)確率達(dá)到90%，其中F1-69、F1-70、F1-71這3個(gè)材料在214和262 bp附近出現(xiàn)“雙峰”；F1-81僅在251 bp處有“單峰”，而F1-86則在251和232 bp兩處附近出現(xiàn)“雙峰”。發(fā)現(xiàn)了控制高粱光敏性的候選基因和，位于高粱第7染色體810 000—1 310 000 bp，獲得特異性引物70.2-3，可在一定程度上改良傳統(tǒng)育種手段，用實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證替代田間測(cè)交觀察，節(jié)省了育種成本，提高了育種效率。

飼草高粱；光敏型；分子標(biāo)記

0 引言

【研究意義】飼草高粱是中國主要青貯飼料，由于其再生能力強(qiáng)、產(chǎn)量高、蛋白質(zhì)豐富、易消化等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧飼喂及漁業(yè)養(yǎng)殖領(lǐng)域[1-2]。光敏感特性是影響飼草高粱產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素[3-4]。在北方夏季長(zhǎng)日照地區(qū)，當(dāng)光照時(shí)長(zhǎng)超過12.3 h時(shí)，具有光敏感特性的飼草高粱不抽穗結(jié)實(shí)，只進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，其高度可超過4 m，部分材料在新疆地區(qū)可長(zhǎng)至6 m，因而產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量比普通飼草高粱高，若部分替代玉米作為哺乳期奶牛飼料，在增加牛奶乳脂肪含量上有顯著效果[5-9]。然而，在光敏型飼草高粱品種選育的過程中，穩(wěn)定后代是否具有光敏特性，必須將其與普通的不育系測(cè)交，第二年種植于大田中，秋天觀察抽穗性狀才能判斷，選育過程中物力、人力、地力投入較多，育種成本非常高，因此，利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)育種方法進(jìn)行改良，提高育種效率顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生物質(zhì)產(chǎn)量是將木質(zhì)素轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物能源的生物質(zhì)或生物能源作物最重要的屬性之一，生長(zhǎng)期是生物質(zhì)產(chǎn)量的首要決定因素。因此，假設(shè)環(huán)境條件允許產(chǎn)量潛力得以發(fā)揮，光敏型高粱積累最多的生物質(zhì)，可達(dá)到普通高粱的2倍以上[10]。目前，已知與高粱光敏性相關(guān)的基因共有6個(gè)，為Ma—Ma[10-11]。早在1945年，美國學(xué)者Quinby等[12]認(rèn)為有3個(gè)基因影響高粱的花期和成熟期，分別為Ma、Ma和Ma。Ma、Ma在沒有Ma的情況下不會(huì)表達(dá)，Ma在顯性Ma存在的情況下也不會(huì)表達(dá)。同時(shí)Ma的作用受光周期的影響，開花時(shí)間控制著葉片的數(shù)量、生長(zhǎng)時(shí)間和植株的最終大小。1965年，Quinby[13-14]又發(fā)現(xiàn)了第4個(gè)與高粱成熟期相關(guān)的基因，并將它命名為Ma，認(rèn)為這4個(gè)基因的表達(dá)受環(huán)境的影響，特別是受光周期和溫度的影響，且花期開始的早晚取決于品種的成熟基因型。20世紀(jì)90年代，Morgan等[11]、Major等[15]從環(huán)境、溫度等因素對(duì)這一概念又進(jìn)行了闡述，之后有關(guān)高粱光敏基因的研究豐富起來。Childs等[16]認(rèn)為Ma是第一個(gè)被克隆的與高粱成熟期相關(guān)的基因，并且有3個(gè)等位基因分別為Ma、ma、ma。Rooney等[17-18]和Morgan等[19]將高粱恢復(fù)系EBA-3去雄后與其他非光敏（photo-insensitive）恢復(fù)系雜交，發(fā)現(xiàn)8個(gè)F2群體中PS/PI分離比率為9﹕7，表明2個(gè)獨(dú)立的基因位點(diǎn)在互補(bǔ)顯性上位中相互作用，而這兩個(gè)與光周期敏感度相關(guān)的基因與先前的Ma、Ma、Ma和Ma不同，從而定名為Ma和Ma，并發(fā)明了基于Ma/Ma系統(tǒng)的生物質(zhì)能源高粱的選育方法。Murphy等[20]認(rèn)為蛋白PRR37控制高粱的開花時(shí)間。Yang等[21-22]認(rèn)為高粱CONSTANS是一種開花的激活劑，在開花抑制劑PRR37的長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)在轉(zhuǎn)錄后受到抑制，有助于光敏感型短日照高粱的開花。Wang等[23]對(duì)Ma的進(jìn)化做了分析。另外，針對(duì)飼草高粱生物產(chǎn)量與光敏感特性的研究，Wolabu等[24-25]認(rèn)為不同類型的高粱在溫帶地區(qū)的應(yīng)用主要取決于其開花時(shí)間的控制，光周期不敏感的高粱用于糧食生產(chǎn)，而光周期敏感基因型則用于飼料和生物量原料生產(chǎn)。關(guān)于光敏感基因定位的研究，Murphy等[20]將Ma定位在高粱第6染色體上的標(biāo)記Xtxi62和Xtxi58之間約86 kb的區(qū)段內(nèi)。Mullet等[26]將Ma定位在高粱第2染色體67 923 811—68 393 290 bp，認(rèn)為該基因可能通過抑制由光敏色素B和C介導(dǎo)的調(diào)節(jié)高粱光照依賴性產(chǎn)物來調(diào)控高粱的開花時(shí)間。Ma是第一個(gè)被成功克隆的調(diào)控高粱感光性的基因，被定位于高粱第1染色體長(zhǎng)臂的末端，在60 910 479—60 917 763 bp。Ma至少有3種等位基因，分別為顯性Ma、隱性Ma和一種特殊的隱性基因Ma[27-29]。Ma被定位在高粱第10染色體，與RFLP標(biāo)記txs1163相鄰[30-31]。Ma被定位到高粱第1染色體6 762 743—6 767 650 bp，在遺傳圖譜上的位置為23—26 cM，對(duì)應(yīng)的基因編碼光敏色素C[26]。Ma被定位在高粱第6染色體39 379 760—42 610 705 bp，它和Ma均受Ma、Ma的遺傳上位性影響，通過抑制一系列成花素基因的表達(dá)，使高粱在長(zhǎng)日照條件下開花時(shí)間延遲。Ma是調(diào)控高粱籽粒數(shù)量、株高和抽穗期的基因——[26]。牛皓等[32]對(duì)144對(duì)SSR引物（包括PRR37（Ma）、GHD7（Ma）、PHYB（Ma）、PHYC（Ma）等基因?qū)?yīng)的引物）進(jìn)行篩選，篩出4對(duì)疑似光敏感引物，但經(jīng)過與F1雜交種擴(kuò)大群體驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)它們并不是特異性引物，不能將光敏和非光敏的材料區(qū)分開，因而不具備生產(chǎn)使用價(jià)值?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】高粱光敏感基因的理論研究豐富，但利用已有成果形成育種體系應(yīng)用于田間育種的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以具有光敏感特性（photosensitive）的飼草高粱恢復(fù)系晉光1R和普通非光敏（photo-insensitive）飼草高粱恢復(fù)系BMRC-3-2為研究對(duì)象，通過雜交構(gòu)建F2群體，利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)，定位光敏基因，篩選特異性引物，為今后改良高粱品種傳統(tǒng)育種方式，提高育種效率，降低育種成本，進(jìn)而形成新的育種體系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

親本材料：具有光敏基因的飼草高粱恢復(fù)系晉光1R，普通飼草高粱恢復(fù)系BMRC-3-2。

F2群體：2017年，在山西榆次以光敏恢復(fù)系晉光1R為母本，非光敏恢復(fù)系BMRC-3-2為父本，經(jīng)人工去雄有性雜交得到F0種子；2017年冬，在海南三亞種植F0種子，并自交，得到F1種子，2018年，獲得晉光1R/BMRC-3-2的F2群體。

F1雜交種：以晉光1R為親本選育的高代穩(wěn)定恢復(fù)系作為父本，與其他不育系測(cè)配得到的F1雜交種。

部分SSR標(biāo)記序列來源于NCBI網(wǎng)站，部分由上海派森諾生物科技有限公司依據(jù)候選基因序列設(shè)計(jì)合成。

材料種子由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所提供。所有試驗(yàn)材料均種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所東白試驗(yàn)基地。田間管理與其他普通高粱一致，2018年8月底調(diào)查抽穗情況。

1.2 表型鑒定及遺傳分析

取樣前，對(duì)親本及群體單株進(jìn)行光敏和非光敏性狀調(diào)查統(tǒng)計(jì)。根據(jù)表型鑒定結(jié)果計(jì)算分離比例，并進(jìn)行卡方檢測(cè)，確定光敏性狀在F2群體中的分離情況，用于遺傳分析。

1.3 DNA提取及近等基因池的構(gòu)建

為確保取樣的準(zhǔn)確性，在8月底高粱抽穗尾期，按照光敏（不抽穗）與非光敏（抽穗）將F2分兩類，每類隨機(jī)各選30株，分別掛牌標(biāo)記，取頂部新鮮幼葉放入2 ml離心管中，液氮速凍，由上海派森諾生物科技有限公司提DNA及進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。同時(shí)，將1.1內(nèi)容中F1雜交種，也按照光敏與非光敏分兩類，每類隨機(jī)各取50株頂端新鮮幼葉放入2 ml離心管中，液氮速凍，由上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.4 BSA試驗(yàn)

構(gòu)建基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用第二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS），對(duì)插入片段為400的文庫進(jìn)行雙末端（paired-end，PE）測(cè)序。通過對(duì)目標(biāo)性狀區(qū)域分析，確定基因位置。

1.5 微衛(wèi)星標(biāo)記驗(yàn)證試驗(yàn)

將F1雜交種DNA進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，驗(yàn)證特異性引物。

2 結(jié)果

2.1 表型鑒定和遺傳分析

晉光1R與BMRC-3-2雜交，對(duì)F2進(jìn)行性狀調(diào)查，其中，251株不抽穗，169株抽穗，經(jīng)c2檢驗(yàn)光敏與非光敏（PS/PI）的分離比例符合9﹕7（表1）。

2.2 基因初步定位及功能注釋

經(jīng)過測(cè)序，選取99%閾值線最高點(diǎn)前后約250 kb的區(qū)域作為性狀相關(guān)的候選區(qū)域，區(qū)域總長(zhǎng)度為500 kb，這個(gè)范圍內(nèi)滿足條件的SNP位點(diǎn)共400個(gè)，對(duì)這些SNP位點(diǎn)注釋，其中，非同義突變或者stop-gain或者stop-loss的SNP位點(diǎn)有6個(gè)，分布在4個(gè)基因。關(guān)聯(lián)區(qū)域位于第7染色體810 000—1 310 000 bp（圖1）。

表1 F2光敏性狀的遺傳模式

c20.05,1=3.84

圖1 子代混池 SNP index和△(SNP index)在染色體上的分布

4個(gè)候選基因分別為、、和。通過與GO、KEFG、Swiss Prot、NR等數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋，其中和都是剪切因子基因，因而，認(rèn)為它們可能就是與飼草高粱光敏感相關(guān)的基因。

2.3 特異性SSR引物的獲得及分子輔助育種體系的建立

在F1材料的DNA中選取光敏與非光敏單株各2株，根據(jù)候選基因序列設(shè)計(jì)合成的引物共51對(duì)，進(jìn)行熒光定量PCR，每組引物前2條帶為非光敏F1，后2條帶為光敏F1（圖2）。

M：DL2000 DNA Maker；1—51：70.2-1、70.2-2、70.2-3、70.2-152-1、70.2-152-2、70.2-152-3、71.2-229-1、71.2-229-2、71.2-229-3、72.2-1、72.2-2、72.2-3、73.2-1、73.2-2、73.2-3、75.2-833-1、75.2-833-2、75.2-833-3、75.2-392-1、75.2-392-2、75.2-392-3、75.2-384-1、75.2-384-2、75.2-384-3、75.2-036-1、75.2-036-2、75.2-036-3、75.2-258-1、75.2-258-2、75.2-258-3、77.2-751-1、77.2-751-2、77.2-751-3、77.2-050-1、77.2-050-2、77.2-050-3、78.2-409-1、78.2-409-2、78.2-409-3、78.2-005-1、78.2-005-2、78.2-005-3、79.2-488-1、79.2-488-2、79.2-488-3、79.2-924-1、79.2-924-2、79.2-924-3、79.2-797-1、79.2-797-2、79.2-797-3

根據(jù)圖2結(jié)果，將個(gè)別差異極不明顯的引物排除，其余引物擴(kuò)大樣本至100個(gè)F1材料進(jìn)行毛細(xì)管電泳驗(yàn)證。結(jié)果表明，僅有引物70.2-3可以區(qū)分光敏與非光敏F1材料（圖3）。非光敏型F1雜交種在251 bp 附近出現(xiàn)“單峰”；而光敏型則在214和251 bp兩處附近出現(xiàn)“雙峰”；光敏親本和非光敏親本則分別在214和251 bp附近出現(xiàn)“單峰”。以251 bp處出現(xiàn)“單峰”為判斷依據(jù)，引物70.2-3對(duì)50個(gè)非光敏型F1雜交種的鑒選準(zhǔn)確率達(dá)到100%，所有材料均在251 bp附近出現(xiàn)峰值。以214和251 bp兩處附近出現(xiàn)“雙峰”為判斷依據(jù)，該引物對(duì)另外50個(gè)光敏型F1雜交種鑒選的準(zhǔn)確率達(dá)到90%，其中F1-69、F1-70、F1-71這三個(gè)材料在214和262 bp附近出現(xiàn)“雙峰”；F1-81僅在251 bp處有“單峰”而F1-86則在251和232 bp兩處附近出現(xiàn)“雙峰”。據(jù)此，認(rèn)為所選引物70.2-3為特異性引物，可以區(qū)分光敏和非光敏雜交種，可以作為田間生產(chǎn)指導(dǎo)。其序列為FORWARD PRIMER：5′-CCTCCTCTTCCTCGGATAGC-3′和REVERSEPRIMER：5′-ATGATCGGTGGT TG GAAGAG-3′。

Sample1和Sample2為非光敏型F1雜交種，Sample3和Sample4為光敏型F1雜交種，Sample5為光敏親本晉光1R，Sample6為非光敏親本BMRC-3-2

綜上所述，對(duì)傳統(tǒng)的光敏感飼草高粱選育體系進(jìn)行改良，利用實(shí)驗(yàn)室篩選代替田間測(cè)交，形成新的分子輔助育種體系（圖4）。

圖4 新舊育種體系對(duì)比示意圖

3 討論

3.1 傳統(tǒng)選育方式

光敏型飼草高粱恢復(fù)系的選育，以傳統(tǒng)高粱恢復(fù)系選育方法為基礎(chǔ)，選擇具有光敏特性的飼草高粱恢復(fù)系與普通非光敏但具有其他優(yōu)良性狀的飼草高粱恢復(fù)系人工去雄有性雜交，獲得F0種子，通過南繁加代也可下一年種植大田得到F1，F(xiàn)1套袋自交后第二年得到F2群體。從這一步開始傳統(tǒng)的育種方法需另選不育系A(chǔ)與選出的F2群體單株一一測(cè)交，得到雜交種T，翌年田間種植后再觀察抽穗情況，從而判定上年測(cè)交F2群體中哪株為光敏型。

3.2 分子輔助育種選育方式

分子輔助育種選育方式與傳統(tǒng)育種方式在獲得F2群體的方法上保持一致，但將工作量最繁瑣的田間測(cè)交驗(yàn)證這一步用實(shí)驗(yàn)室熒光定量PCR方法取代，利用篩選的特異性SSR引物70.2-3將所有F2群體中的個(gè)體進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，觀察214和251 bp處的“峰值”情況，兩處均出現(xiàn)“峰”則判定為光敏型，非光敏型則淘汰。結(jié)果表明，該引物篩選光敏材料準(zhǔn)確度非常高，但仍有極少部分材料出現(xiàn)峰值位移，這與部分“中間型”材料取樣分類誤差有關(guān)。同時(shí)，候選基因和定位在第7染色體，與目前所有已知的與高粱光敏感性相關(guān)的基因位置都不同，是否是新的光敏基因，其調(diào)控機(jī)理如何還需進(jìn)一步研究確定，但F2群體中光敏與非光敏（PS/PI）分離比例為9﹕7，這說明飼草高粱光敏感特性是由2個(gè)獨(dú)立的互補(bǔ)顯性基因控制，這與Rooney[17]研究結(jié)果相同。

3.3 分子輔助育種體系優(yōu)點(diǎn)

本研究創(chuàng)造的光敏型飼草高粱分子輔助育種體系是對(duì)傳統(tǒng)育種體系的改良，優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在：1）節(jié)約育種時(shí)間；2）節(jié)省育種成本。通過對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的育種體系比分子輔助育種體系的育種年限要多1年，而多出來的這一年必然會(huì)引起育種成本的增加。假設(shè)F2群體共200株，每株均與不育系A(chǔ)測(cè)交，收獲測(cè)交種子200份，第二年以每15 m2小區(qū)種6行，每2行種1個(gè)材料來計(jì)算，大約需要67個(gè)小區(qū)0.1 hm2，以2019年每公頃地育種成本來計(jì)算，需約6 000元，而實(shí)驗(yàn)室熒光定量PCR耗材費(fèi)用不超過2 000元。如果F2群體數(shù)量龐大，后者將節(jié)省更多的育種成本。

綜上所述，調(diào)控高粱抽穗期性狀的基因很多，而且等位基因也很豐富，并且影響不同雜交組合產(chǎn)生后代的抽穗期性狀的QTL位點(diǎn)各不相同，調(diào)控高粱抽穗期性狀的基因之間互作方式也是多種多樣。因此，盡可能多的發(fā)掘調(diào)控高粱抽穗期性狀的基因位點(diǎn)，明確基因功能及互作模式，對(duì)于揭示高粱光敏感特性的機(jī)理、提高育種效率、節(jié)約育種成本有著重要的意義。

4 結(jié)論

發(fā)現(xiàn)控制高粱抽穗期的候選基因和，位于高粱第7染色體810 000— 1 310 000 bp。同時(shí)特異性SSR引物70.2-3的獲得，在飼草高粱光敏性鑒定上有極高的準(zhǔn)確率，基于該引物構(gòu)建的光敏型飼草高粱選育體系，利用實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證替代田間測(cè)交觀察，節(jié)省育種成本，提高育種效率。

[1] 平俊愛, 謝國強(qiáng), 張福耀, 何余湧, 吳志勇, 王榮民, 呂鑫, 杜志宏, 李慧明, 牛皓, 王玉斌. 晉牧1號(hào)在南方紅壤區(qū)的產(chǎn)草量: 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及飼養(yǎng)效果研究. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 46(35): 94-96.

PING J A, XIE G Q, ZHANG F Y, HE Y Y, WU Z Y, WANG R M, Lü X, DU Z H, LI H M, NIU H, WANG Y B. Breeding and characteristic ofבJinmu1’., 2018, 46(35): 94-96. (in Chinese)

[2] 平俊愛, 張福耀, 牛皓,楊慧勇, 呂鑫, 杜志宏, 李慧明, 王玉斌. 基于SSR標(biāo)記的飼草高粱種質(zhì)資源遺傳多樣性分析. 分子植物育種, 2018, 16(14): 4663-4670.

PING J A, ZHANG F Y, NIU H, YANG H Y, Lü X, DU Z H, LI H M, WANG Y B. Genetic diversity analysis of germplasm resources of forage sorghum based on SSR marker., 2018, 16(14): 4663-4670. (in Chinese)

[3] Bhosale S U, Benjamin S, Rattunde H F W, Weltzien E, Haussmann B I, Haussmann C T, Ramu P, Cuevas H E, Paterson A H, Melchinger A E, Parzies H K. Association analysis of photoperiodic flowering time genes in west and central[(L.) Moench]., 2012, 12: 32-41.

[4] Casto A L, Mattison A J, Olson S N, Thakran M, Rooney W L, Mullet J E. Maturity2, a novel regulatorof flowering time in, increases expression of SbPRR37 and SbCO in long days delaying flowering., 2019, 14(4): e0212154.

[5] Sukumaran S, Li X, Li X R, Zhu C S, Bai G H, Perumal R, Tuinstra M R, Prasad P V V, Mitchell S E, Tesso T T, Yu J. QTL mapping for grain yield, flowering time, and stay-green traits in sorghum with genotyping-by-sequencing markers., 2016, 56(4): 1429-1442.

[6] Tuinstra M R, Grote E M, Goldsbrough P B, Ejeta G. Genetic analysis of post-flowering drought tolerance and components of grain development in(L.) Moench., 1997, 3(6): 439-448.

[7] Spindel J E, Dahlberg J, Colgan M, Hollingsworth J, Sievert J, Staggenborg S H, Hutmacher R, Jansson C, Vogel J P. Association mapping by aerial drone reveals 213 genetic associations for Sorghum bicolor biomass traits under drought., 2018, 19: 679-696.

[8] Wang Y H, Upadhyaya H D, Burrell A M, Sahraeian S M, Klein R R, Klein P E. Genetic structure and linkage disequilibrium in a diverse, representative collection of the C4 model plant., 2013, 3(5): 783-793.

[9] Harper M T, Oh J, Giallongo F, Lopes J C, Roth G W, Hristov A N. Using brown midrib 6 dwarf forage sorghum silage and fall-grown oat silage in lactating dairy cow rations., 2017, 100(7): 5250-5265.

[10] Mullet J E, Rooney W L, Klein P E, Bryan D M, Bryan R M, Brady J A. Discovery and utilization of sorghum genes (Ma5/Ma6). 13/744405[P].2013-09-12.

[11] Morgan P W, Finlayson S A, Lee I J, Childs K L, He C J, Creelman R A, Drew M C, Mullet J E. Regulation of circadianly rhythmic ethylene production by phytochrome b in sorghum., 1997(1): 105-111.

[12] Quinby J R, Karper R E. The inheritance of three genes that influence time of floral initiation and maturity date in Milo1., 1945(11): 916-936.

[13] Quinby J R. Fourth maturity gene locus in sorghum., 1965(6): 516-518.

[14] Quinby J R. The maturity genes of sorghum., 1967(19): 267-305.

[15] Major D J, Rood S B, Miller F R. Temperature and photoperiod effects mediated by the sorghum maturity genes., 1990, 30(2): 305-310.

[16] Childs K L, Lu J L, Mullet J E, Morgan P W. Genetic regulation of development in: X. Greatly attenuated photoperiod sensitivity in a phytochrome-deficient sorghum possessing a biological clock but lacking a red light-high irradiance response., 1995, 108(1): 345-351.

[17] Rooney W L, Jürg B, Bean B, Mullet J E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock., 2007, 1(2): 147-157.

[18] Rooney W L, Aydin S. Genetic control of a photoperiod-sensitive response in(L.) Moench., 1999, 39(2): 397-400.

[19] Morgan P W, Finlayson S A, Childs K L, Mullet J E, Rooney W L. Opportunities to improve adaptability and yield in grasses., 2002, 42(6): 1791-1799.

[20] Murphy R L, Klein R R, Morishige D T, Brady J A, Rooney W L, Miller F R, Dugas D V, Klein P E, Mullet J E. Coincident light and clock regulation of pseudo response regulator protein 37 (PRR37) controls photoperiodic flowering in sorghum., 2011, 108(39): 16469-16474.

[21] Yang S S, Weers B D, Morishige D T, Mullet J E. CONSTANS is a photoperiod regulated activator of flowering in sorghum., 2014, 14(1): 148-162.

[22] Yang S S, Murphy R L, Morishige D T, Klein P E, Rooney W L, Mullet J E. Sorghum phytochrome B inhibits flowering in long days by activating expression of SbPRR37 and SbGHD7, repressors of SbEHD1, SbCN8 and SbCN12., 2014, 9(8): e105352.

[23] Wang Y, Tan L B, Fu Y C, Zhu Z F, Liu F X, Sun C, Cai H W. Molecular evolution of the sorghum maturity gene Ma3., 2015, 10(5): e0124435.

[24] Wolabu T W, Tadege M. Photoperiod response and floral transition in sorghum., 2016, 11(12): e1261232.

[25] Wolabu T W, Zhang F, Niu L F, Kalve S, Mathur P B, Muszynski M G, Tadege M. Three FLOWERING LOCUS T-like genes function as potential florigens and mediate photoperiod response in sorghum., 2016, 210(3): 946-959.

[26] Mullet J E, Rooney W L. Method for production of sorghum hybrids with selected flowering times. 13/886130[P].2016-08-30.

[27] Childs K L, Miller F R, Cordonnier Pratt M M, Pratt L H, Morgan P W, Mullet J E. The sorghum photoperiod sensitivity gene, Ma3encodes a phytochrome B., 1997, 113(2): 611-619.

[28] Childs K L, Cordonnier Pratt M M, Pratt L H, Morgan P W. Genetic regulation of development in Sorghum bicolor: VII. Ma3Rflowering mutant lacks a phytochrome that predominates in green tissue., 1992, 99(2): 765-770.

[29] Childs K L, Pratt L H, Morgan P W. Genetic regulation of development in: VI. The Ma3Rallele results in abnormal phytochrome physiology., 1991, 97(2): 714-719.

[30] Hart G E, Schertz K F, Peng Y, Syed N H. Genetic mapping of(L.) moench QTLs that control variation in tillering and other morphological characters., 2001, 103(8): 1232-1242.

[31] Chantereau J, Trouche G, Rami J F, Deu M, Barro C, Grivet L. RFLP mapping of QTLs for photoperiod response in tropical sorghum., 2001, 120(2):183-194.

[32] 牛皓, 平俊愛, 張福耀, 呂鑫, 杜志宏, 李慧明, 王玉斌. 基于SSR的高粱光敏特性分析. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 46(35): 103-105.

NIU H, PING J A, ZHANG F Y, Lü X, DU Z H, LI H M, WANG Y B. Analysis on the photosensitivity of sorghum based on SSR., 2018, 46(35): 103-105. (in Chinese)

Molecular Aided Breeding System of Photosensitive Forage Sorghum Based on SSR

NIU Hao1,2, PING JunAi1,2, WANG YuBin1,2, ZHANG FuYao1,2, Lü Xin1,2, LI HuiMing1,2, CHU JianQiang1,2

(1Sorghum Institute of Shanxi Agricultural University (Shanxi Academy of Agricultural Sciences)/Shanxi Key Laboratory of Sorghum Genetic and Germplasm Innovation, Jinzhong 030600, Shanxi;2Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030031)

【】The aim of this study is to use molecular marker to construct a breeding system to improve the traditional breeding method，thereby reducing breeding costs and improving breeding efficiency.At the same time, it lays a theoretical foundation for the formation of a new breeding system.【】The F2population was constructed by crossing the photosensitive(non-heading) forage sorghum variety Jinguang 1R as female and the photoinsensitive(heading) sorghum variety BMRC-3-2 as male.According to heading and non-heading phenotypes, F2population was divided into two groups. Thirty plants were selected from each group and DNA was extracted from leaves,SSR and BSA were used to map photosensitive genes in F2population of Jinguang 1R/BMRC-3-2 and screen for specific SSR primers.The specific primers were used to identify the photosensitivity trait in F1generation（F1Hybrids breeded from high generation stable restorer line with Jinguang 1R as parent and matched with other male sterile lines）, and the final target primers were determined by comparing with the phenotype in the field, so as to construct a new photosensitive breeding system for forage sorghum.【】After SNP index analysis, the region of about 250 Kb before and after the highest point of 99% threshold line was selected as the candidate region for trait correlation. The total length of the region was 500 kb, with 400 SNP loci, and six of them were non-synonymous mutations or stop gain or stop loss SNP loci.Finally, two candidate genes were identified to be related to photosensitivity, which were located on chromosome 7.A pair of specific primers 70.2-3 was developed by SSR. The primerscan distinguish between heading and non-heading sorghum plants to a great extent.The results showed that according to the "single peak" at 251bp, the accuracy of primers 70.2-3 in the identification and selection of 50 non-photosensitive F1hybrids reached 100%, and all the materials showed a peak value near 251bp.Based on the "double peaks" in the vicinity of 214bp and 251bp, the accuracy rate of the primer for the identification and selection of the other 50 photosensitive F1hybrid species reached 90%. Three materials, No. F1-69, F1-70 and F1-71, showed "double peaks" near 214 bp and 262 bp. Material F1-81 has a "single peak" at 251bp, while material No. 86 has a "double peak" near 251 bp and 232 bp.【】In this study, we revealed that the candidate genes controlling heading date of sorghum were LOC8068537 and LOC8068548, which were between 810000 and 1310000 bp on chromosome 7 of sorghum. The acquisition of specific primers 70.2-3 improved the traditional breeding methods. The primer validation in laboratory could replace the field crossing observation, saving the breeding cost and improving the breeding efficiency.

foragesorghum;photosensitive type; molecular markers

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.14.004

2019-06-06；

2019-08-08

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)勢(shì)課題組自選項(xiàng)目（YYS1706）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-06）、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物育種工程（17yzgc031）、山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（201703D211002-9-1）、釀造專用高粱育種及利用山西省科技創(chuàng)新重點(diǎn)團(tuán)隊(duì)運(yùn)行補(bǔ)助（201805D131012-6）

牛皓，E-mail：nkyglsnh@126.com。通信作者平俊愛，E-mail：pingja1029@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）