黃銳　楊思進　蒲清榮　羅群　趙劍　賴慧　李靜　王饒瓊　任維

摘要：目的優(yōu)選清肺排毒合劑制備工藝。方法以黃芩苷為檢測指標，采用正交試驗法優(yōu)選清肺排毒合劑的水提工藝，并驗證工藝的可靠性。結果最佳制備工藝是：12倍水浸泡0.5 h，提取2次，每次1 h;每劑收集芳香水40 mL，水提液減壓濃縮至200 mL，20000 r/min離心2次。結論優(yōu)選的水提離心工藝合理可行，穩(wěn)定可靠，具可操作性和重復性。

關鍵詞：清肺排毒合劑（新冠1號）;黃芩苷;正交試驗;芳香水;水提;離心

中圖分類號：R965.1文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2020）04-0005-03

為了防控新型冠狀病毒感染的肺炎疫情，2020年2月6日國家衛(wèi)生健康委和國家中醫(yī)藥管理局聯合發(fā)文推薦在中西醫(yī)結合救治新型冠狀病毒感染的肺炎中使用清肺排毒湯（國中醫(yī)藥辦醫(yī)政函〔2020〕22號）。清肺排毒方由漢代張仲景所著《傷寒雜病論》中的多個治療由寒邪引起的外感熱病的經典方劑優(yōu)化組合而成，包括麻杏石甘湯、射干麻黃湯、小柴胡湯和五苓散，組方合理，性味平和[1]，含麻黃、桂枝、炙甘草等二十一味藥，其功能為疏通三焦、清肺排毒、平喘止咳，可用于治療新型冠狀病毒感染的肺炎輕型、普通型、重型患者，在危重癥患者救治中也可結合患者實際情況合理使用。為方便新型冠狀病毒肺炎患者攜帶和使用，以及保證其質量，課題組將其開發(fā)成合劑—清肺排毒合劑，本試驗以黃芩苷為檢測指標，正交試驗優(yōu)選清肺排毒合劑的最佳制備工藝，為全國正在生產清肺排毒合劑的單位提供參考。

1儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀（LC-20AT泵、SPD20A檢測器、CTO-10AS進樣器、LcSolution色譜工作站）;AUW120D電子天平（日本島津）;JA203H型電子天平（常州市幸運電子設備有限公司）;HH數顯電熱恒溫水浴箱（江蘇國勝實驗儀器廠）;JP全數字超聲波發(fā)生器（武漢嘉鵬電子有限公司）;TU-1901紫外可見風光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;101-2AB電熱鼓風干燥箱（杭州匯110715-201308，供爾儀器服務有限公司）。黃芩苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為含量測定用）;麻黃、桂枝、炙甘草、杏仁等藥材（購自瀘州百草堂中藥飲片有限公司，經西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院蒲清榮主任中藥師鑒定，均符合《中國藥典》2015年版一部該藥材項下規(guī)定）;甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1水提工藝的正交設計采用正交試驗法對清肺排毒合劑的水提取工藝進行優(yōu)選。選取加水量、浸泡時間、提取時間、提取次數為考察因素，每個因素3水平，以黃芩苷的相對含量為評價指標，按L9（34）進行試驗，正交因素水平見表1。

2.2含量測定

2.3.1黃芩苷色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），流速1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，檢測波長280 nm，進樣量10 μL，理論塔板數按黃芩苷峰計算應不低于2500[2-3]。

2.3.2黃芩苷對照品溶液的制備精密稱取對照品45.87 mg，用甲醇定容至50 mL棕色量瓶中，精密量取2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，得0.068 472 mg·mL-1溶液。

2.3.3供試品溶液的制備精密稱取麻黃9 g，炙甘草6 g，杏仁9 g，生石膏30 g，桂枝9 g，澤瀉9 g，豬苓9 g，白術9 g，茯苓15 g，柴胡16 g，黃芩6 g，姜半夏9 g，生姜9 g，紫菀9 g，冬花9 g，射干9 g，細辛6 g，山藥12 g，枳實6 g，陳皮6 g，藿香9 g，分別按表1正交因素水平表進行試驗，浸泡，水煎煮，過濾，濃縮，定容至250 mL容量瓶中，搖勻，精密量取2.5 mL置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.4標準曲線的繪制精密量取2.3.2項下對照品貯備液0.2 mL置25 mL量瓶中，分別吸取2 mL，4mL，6 mL，8 mL，10mL置10 mL量瓶中，分別用甲醇定容至相應刻度，搖勻，制得濃度分別為6.85，171.19，342.37，513.56，684.75，855.93 μg·mL-1的溶液，依次吸取10 μL注入液相色譜儀，測定。以峰面積（A）為縱坐標（Y），黃芩苷的濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X），繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=32245X-288027，r2=0.9994（n=6）。

2.3.5精密度試驗取2.3.4項下濃度為171.19 μg·mL-1對照品溶液10 μL，按2.3.1項下色譜條件測定，連續(xù)進樣5次，測得黃芩苷平均峰面積5355031，RSD為1.60%。表明儀器精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性試驗取2.3.3項下制備的供試品溶液，分別于放置0，1.5，3，6，9，12 h各進樣一次，每次10 μL，按2.3.1項下色譜條件測黃芩苷峰面積，RSD分別為1.45%，表明供試品溶液在12 h內基本穩(wěn)定。

2.3.7重復性試驗取正交因素表1中正交試驗提取液5號樣品，按照2.3.3項下方法制備6份供試品，按2.3.1項下色譜條件測定峰面積計算黃芩苷成分含量，RSD分別為1.22%。表明試驗重復性良好。

2.3.8回收率試驗取9份已知含量的樣品，分為3組，每組加入適量的黃芩苷對照品，按2.3.3項下制備9份供試品溶液，按2.3.1下色譜條件測定峰面積，計算平均加樣回收率，結果黃芩苷收率分別為100.64%（RSD為1.18%）。表明此方法可行。

2.3.9專屬性試驗精密量取供試品溶液缺黃芩苷的陰性樣品，按供試品制備方法制備，測定，結果表明黃芩苷其他組分對測定黃芩苷無干擾，本方法專屬性強。

2.3.10耐用性取正交因素表1中正交試驗提取液5號樣品，按供試品制備方法制備，分別在色譜條件小的變動條件下：波長280±2nm，柱溫40±5℃，測定黃芩苷含量，結果表明：波長、柱溫小的變動時耐用性合適，滿足系統適應性要求，本方法可靠。

2.3.11樣品測定按2.3.1項下色譜條件，分別測定2.3.3項下供試品溶液中黃芩苷的含量，結果見圖1。

2.4試驗結果以及數據分析

2.4.1芳香水收集工藝研究清肺排毒合劑方中藥材含較多揮發(fā)性成分，為了保留其揮發(fā)性成分，考察每劑收取芳香水的體積。按處方比例稱取藥材，加入10倍水，收集芳香水，每次10 mL，收集10次，稀釋100倍后，用紫外可見分光光度計在200-400 nm光譜掃描。實驗結果表明，前4次有較強的吸收，第5次吸收光度顯著降低。故確定芳香水提取工藝為每劑收集40 mL芳香水。

2.4.2水提工藝采用正交試驗優(yōu)選清肺排毒合劑的水提工藝，按處方比例稱取藥材，進行正交因素表1的9組試驗，按2.3.3水提供試品溶液制備樣品，2.3.1項下色譜條件進行檢測，以黃芩苷相對含量為指標，進行統計分析。結果見表2，表3。

由方差分析結果可知，D因素提取次數對于指標影響最大，經直觀分析，其影響大小的順序為提取次數>加水量>煎煮時間>浸泡時間，綜合考慮，得最佳水提條件為A3B1C2D2，即加入12倍水，浸泡0.5 h，提取2次，每次1 h。

2.4.3水提工藝驗證試驗按處方比例稱取藥材，以最佳水提工藝條件，進行3次試驗，測得黃芩苷的平均相對含量為53.57 mg·g-1，RSD為0.98%。優(yōu)于正交9次試驗，證明上述正交試驗所得到的最佳水提工藝可行，重現性好。

2.4.4離心工藝研究為了除去不溶于水的雜質，減少有效成分的損失，便于患者服用，以及考慮實際生產，對其離心工藝進行了研究。以離心轉速20000 r/min，進液流速為3 L/min，考察了離心次數對液體沉淀量的影響。離心1次，沉淀依然較多，而離心2次和3次沉淀明顯減少，但相差不大，故從實際生產出發(fā)，選擇離心2次。

3討論

清肺排毒合劑處方來源于國家中醫(yī)藥管理局辦公室、國家衛(wèi)健委辦公廳聯合印發(fā)的《關于推薦在中西醫(yī)結合救治新型冠狀病毒感染的肺炎中使用“清肺排毒湯”的通知》，前期臨床觀察療效顯著。但湯劑服用、攜帶不方便，也不利于及時搶救危重病人，易發(fā)霉、發(fā)酵、不能久貯等，結合清肺排毒方處方量大，芳香水多，將該方開發(fā)成合劑，每劑250 mL，保留了湯劑的優(yōu)點，還方便新冠肺炎患者攜帶和服用，保證質量。

黃芩作為清肺排毒方中重要組成藥味，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效。主治溫熱病、上呼吸道感染、肺熱咳嗽、濕熱黃膽、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎動不安、高血壓、癰腫癤瘡等癥[4-5]。所含有效成分主要是黃酮及其苷類、萜類化合物及揮發(fā)油等成分[6-7]。黃芩的主要有效成分黃芩苷[8]具有抑菌、抗炎、降壓、抗變態(tài)反應等藥理作用，臨床上可用于肺炎、腦缺血、肝炎、感染和腫瘤等疾病治療。黃芩苷檢測方便，穩(wěn)定性好。故，選擇黃芩苷作為優(yōu)選清肺排毒合劑水提工藝的成分指標。

本試驗選擇離心工藝作為清肺排毒合劑澄清工藝的方式，未采用傳統的水提醇沉。工藝中加入乙醇沉淀，時間長，生產成本增加，且滅菌后跟離心工藝處理的樣品，沉淀量差不多，故采用離心工藝。

參考文獻：

[1]國家衛(wèi)生健康委員會辦公廳，國家中醫(yī)藥管理局辦公室.關于推薦在中西醫(yī)結合救治新型冠狀病毒感染的肺炎中使用“清肺排毒湯”的通知【國中醫(yī)藥辦醫(yī)政函〔2020〕22號】.[2020-02-06].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：301.

[3]劉秋艷，金燕飛，段佩利.雙指標綜合評分法優(yōu)化谷青通竅顆粒提取工藝[J].時珍國醫(yī)國藥，2019，30（11）：2651-2653.

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[7]陳佩東，徐丹洋，李芳，等.UPLC-MS法分析黃芩炮制前后化學成分變化[J].中成藥，2013，35（4）：784-788.

[8]龍宇，向燕，譚裕君，等.黃芩苷藥理作用及新劑型的研究進展[J].中草藥，2019，50（24）：6142-6148.

（收稿日期：2020-04-02）

基金項目：國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治新型冠狀病毒肺炎應急研究專項課題（編號：2020ZYLCYJ02-3）;西南醫(yī)科大學-西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院聯合項目（編號：2020XYLH-003）

作者簡介：黃銳（1986-），男，主管中藥師，碩士，研究方向：中藥新制劑研究。

通信作者：楊思進，E-mail：ysjimn@sina.com