祝清燦

國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550026

豬毛蒿為菊科植物豬毛蒿ArtemisiascopariaWaldst.et Kit.的地上部分，經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取得豬毛蒿精油。豬毛蒿精油為淺黃色至棕黃色澄清液體，有特異香氣，味微辛，據(jù)文獻(xiàn)[1-4]報(bào)道，對(duì)真菌有很強(qiáng)的抑制作用，藏族地區(qū)民間常用于治療手、足癬等皮膚病，是藏藥婦潔搽劑[5]的主要成分之一。豬毛蒿精油化學(xué)成分以單萜為主(80.74%)，主要成分有丁香酚、桉葉素、檸檬烯、β-丁香烯、α-蒎烯、β-蒎烯等[6-8]。丁香酚是豬毛蒿精油中的主要成分，具有麻醉、抗菌防腐、殺蟲(chóng)、解熱、降溫、抗性氧化、抗衰老等藥理作用[9]。Pinto等[10]研究發(fā)現(xiàn)丁香酚不僅對(duì)皮膚癬菌屬和曲霉菌屬具有抗菌活性，而且對(duì)氟康唑有天然耐藥的克柔念株菌和易誘導(dǎo)耐藥的光滑念珠菌均表現(xiàn)出較高的抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌等12種細(xì)菌具有較好的抗菌作用[11-12]。

丁香酚存在于豬毛蒿精油中，是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的活性成分。為了控制豬毛蒿精油產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法進(jìn)行豬毛蒿精油鑒別，采用氣相色譜法(GC—MS聯(lián)用)對(duì)豬毛蒿精油中的丁香酚進(jìn)行含量測(cè)定，為制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

安捷倫6890A-5973氣質(zhì)聯(lián)用儀，AB104-N電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，ZF-I三用紫外分析儀，YOKO-ZS薄層色譜成像儀(武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn))。

丁香酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110725-201414)，豬毛蒿精油對(duì)照提取物(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：610007-201501)，豬毛蒿由青海省食品藥品檢驗(yàn)所楊鳳梅主任鑒定，化學(xué)試劑為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，硅膠G預(yù)制板(德國(guó)默克公司生產(chǎn)，批號(hào)HX242369)。

豬毛蒿精油樣品(批號(hào)為20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106)，由青海普蘭特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 鑒別 取本品100 mg，加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取豬毛蒿油對(duì)照提取物，同法制成對(duì)照提取物溶液。再取丁香酚對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含5 μL的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[13]試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶70∶7)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照提取物和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)(A)。置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照提取物和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)(B)。結(jié)果如圖1所示。

A 日光下檢視1～5.樣品 6.豬毛蒿精油對(duì)照提取物 7.丁香酚對(duì)照品 8～12.樣品

2.2 丁香酚含量的GC法測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：TR-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm，膜厚0.25 μm)；載氣為高純氮?dú)?，純?99.999%。流速1.5 mL·min-1；柱溫為程序升溫：初始溫度為80 ℃，以每分鐘5 ℃的速率升溫至140 ℃，再以每分鐘50 ℃的速率升溫至220 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；檢測(cè)器為240 ℃；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1。理論板數(shù)按丁香酚峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。如圖2所示。

A.丁香酚對(duì)照品 B.豬毛蒿精油供試品 C.溶劑圖2 豬毛蒿精油及丁香酚GC圖

在上述條件下，在圖2-A中，對(duì)照品丁香酚的峰出現(xiàn)在tR8.99,在圖2-B中，出現(xiàn)與對(duì)照品丁香酚保留時(shí)間相似的峰tR8.99，應(yīng)為樣品中的丁香酚，且與樣品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取丁香酚對(duì)照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為測(cè)定用對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品約0.1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 對(duì)豬毛蒿油供試品溶液進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析，具體參數(shù)如下：色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為高純氦氣，純度>99.999%。流速1.2 mL·min-1；柱溫為程序升溫：初始溫度為80 ℃，以每分鐘10 ℃的速率升溫至240 ℃，保持4 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；檢測(cè)器為260 ℃；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1。電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；連接線溫度：280 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃。結(jié)果：分子離子峰的質(zhì)荷比為164.1，保留時(shí)間(9.96)與丁香酚峰相似，其裂解與丁香酚相同，豬毛蒿精油供試品中丁香酚峰質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)(安捷倫Chemstation色譜工作站NIST MS Search 2.0標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù))中丁香酚的質(zhì)譜圖匹配度為98%，其特征離子為77、103、149和164(其中164為定量離子)，且對(duì)應(yīng)質(zhì)譜碎片離子的質(zhì)荷比與標(biāo)準(zhǔn)一致，其豐度比偏差在規(guī)定范圍內(nèi)，因此可認(rèn)為是同一物質(zhì)。如圖3、圖4所示。

圖3 豬毛蒿精油供試品中丁香酚峰的 MS圖

圖4 丁香酚對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取丁香酚對(duì)照品0.04656g(含量按100.0%計(jì)算)，置50mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度為931.2 μg·mL-1。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯稀釋配制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為：46.56、93.12、186.2、232.8、465.6 μg·mL-1。分別精密吸取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，按照“2.2.1色譜條件”測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，線性回歸方程為：Y= 12599767.5X-23282.6(r=0.99999)。結(jié)果表明：丁香酚進(jìn)樣量在0.04656～0.4656 μg范圍內(nèi)與峰面積值具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)20180906)，分別于0、1、2、4、10 h測(cè)定其峰面積，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果供試品丁香酚峰面積的RSD=1.7%。表明制備的供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)20180906)精密稱取0.1 g,各6份，按2.2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果丁香酚含量的平均值為：52.52 mg·g-1，RSD為1.6%，說(shuō)明試驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取丁香酚對(duì)照品0.04656g(含量按100.0%計(jì)算)，置50 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，備用(含丁香酚0.9312 mg·mL-1)。

取同一批號(hào)樣品(批號(hào)20180906，含丁香酚為52.52 mg·g-1)各6份，每份約0.05 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別精密加入回收對(duì)照溶液3 mL，按含量測(cè)定的方法制備回收用供試品溶液并測(cè)定含量，計(jì)算丁香酚的平均回收率為101.2%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 丁香酚加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.2.9 樣品的測(cè)定 取20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106共10批樣品，照上述含量測(cè)定方法測(cè)定丁香酚含量，結(jié)果分別為：60、71、52、63、81、62、65、76、87、48mg·g-1。平均值為66.5mg·g-1，最低值為48mg·g-1。

經(jīng)過(guò)上述方法學(xué)驗(yàn)證和耐用性試驗(yàn)考察，結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)的色譜條件對(duì)丁香酚的定量測(cè)定專屬性高、重現(xiàn)性好、分離能力強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便。

3 討論

3.1 薄層色譜法供試品制備 比較了供試品乙酸乙酯、丙酮和三氯甲烷溶解，以乙酸乙酯為溶劑制備供試品溶液分離度較好，斑點(diǎn)清晰。

3.2 薄層色譜條件選擇 曾采用環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶70∶7)、石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9∶1)、苯-丙酮(19∶1)等展開(kāi)劑進(jìn)行分離，結(jié)果表明以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶70∶7)分離效果最好，特征斑點(diǎn)清晰。

3.3 丁香酚含量測(cè)定研究 采用GC—MS聯(lián)用技術(shù)，比僅采用氣相色譜法測(cè)定含量提高了可靠性和準(zhǔn)確性。分別比較了正己烷、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、石油醚(30～60 ℃)為提取溶劑的丁香酚含量結(jié)果，結(jié)果表明：以乙酸乙酯作為供試液溶劑，樣品中丁香酚溶解完全，測(cè)得含量較高，故最終選用乙酸乙酯為溶劑。

3.4 氣相色譜法耐用性考察 采用不同的進(jìn)樣口溫度(210 ℃、220 ℃、230 ℃)、不同的檢測(cè)器溫度(230 ℃、240 ℃、250 ℃)和不同的柱溫(70 ℃、80 ℃、90 ℃)及不同品牌和長(zhǎng)度的色譜柱(TR-5，30 m×0.32 mm，0.25 μm和HP-5，25 m×0.32 mm，0.17 μm)進(jìn)行耐用性試驗(yàn)考察。結(jié)果表明，在不同的進(jìn)樣口溫度、不同的檢測(cè)器溫度、不同的柱溫及不同品牌的色譜柱的小范圍變動(dòng)情況下具有耐用性，均可準(zhǔn)確檢出丁香酚。

豬毛蒿精油中有較高含量的抑菌有效成分丁香酚，廣泛應(yīng)用于臨床及工業(yè)化中藥制劑的生產(chǎn)，因此，建立豬毛蒿精油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制精油質(zhì)量顯得尤為重要，筆者的研究結(jié)果為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。