陳增，廖錦容，蘇穎，何志勇，胡丹，林可焴，金善豐，林仁章，林賢東,4

0 引言

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居世界首位[1]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）已成為對(duì)TKI敏感的晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者一線治療的首選用藥[2]。EGFR-TKI獲得性耐藥是導(dǎo)致NSCLC患者靶向治療失敗的重要原因之一。人EGFR T790M點(diǎn)突變是獲得性耐藥最常見的機(jī)制，約占50%以上，但仍有部分腫瘤出現(xiàn)耐藥的機(jī)制不明確[3]。ADP-核糖基化樣因子4C（ARL4C）也稱為Arl7，是ADP-核糖基化因子（ADP-ribosylation factor,Arf）的亞家族成員之一，在細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要作用[4]。越來越多的研究表明，ARL4C與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但ARL4C在腫瘤中的作用機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討ARL4C在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系以及對(duì)EGFR-TKI耐藥的影響。

1 材料和方法

1.1 樣本收集、細(xì)胞和主要試劑

收集2016年1月—2018年6月于福建省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行外科手術(shù)的63例NSCLC患者的癌組織和癌旁組織，其中男34例，女29例。所有患者術(shù)前均未接受過任何治療，新鮮組織獲取后立即放入液氮，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，整個(gè)收集及保存過程均按照無酶原則操作。按照UICC/AJCC第8版肺癌TNM分期：Ⅰ期31例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期3例。鱗癌15例，腺癌48例。本研究經(jīng)過福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：SQ2019-021-01），所有患者均在手術(shù)前簽署知情同意書。

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株HCC827（EGFR 19del）為厄洛替尼（Erlotinib）敏感細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（AT C C），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（FBS,美國Gibco公司），Erlotinib（美國Selleck公司），RNeasy Mini Kit（德國Qiagen公司），ARL4C（英國Abcam公司），β-actin、anti-rabbit HRP-conjugated IgG antibody（美國Cell Signaling Technology公司）。RevertAid?第一鏈cDNA Synthesis試劑盒、HRP的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（美國Thermo公司）。Transwell小室（美國Millipore公司），MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（美國Promega公司）。ARL4C過表達(dá)慢病毒HBLV和HBLV-ARL4C（中國漢恒生物科技公司）。

1.2 EGFR基因檢測(cè)

DNA提取試劑盒購自德國Qiagen，通過石蠟包埋標(biāo)本提取DNA。ARMS法擴(kuò)增采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（安捷倫Mx300p）。EGFR基因檢測(cè)試劑盒均購自廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司。所有病例檢測(cè)均有陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，操作嚴(yán)格按照ARMS法試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、TKI耐藥細(xì)胞株建立和病毒感染

將HCC827細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代一次，采用對(duì)數(shù)生長細(xì)胞。HCC827細(xì)胞暴露于初始濃度為10 nmol/L的Erlotinib溶液中，并逐漸增加藥物濃度至1 600 nmol/L。經(jīng)過6月的篩選后撤除Erlotinib繼續(xù)培養(yǎng)2月，MTS檢測(cè)其IC50為1 843 nmol/L（為HCC827細(xì)胞的6.37倍），標(biāo)記為TKI Erlotinib耐藥細(xì)胞株HCC827/ER。耐藥細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%FBS、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI l640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次。HBLV和HBLV-ARL4C病毒以載體購自漢恒生物科技公司；HCC827/ER細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待24 h后換液，以上各病毒MOI值為10，與6 μg/ml聚凝胺混合感染細(xì)胞，48 h后，用2 μg/ml嘌呤霉素篩選細(xì)胞兩周，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ARL4C過表達(dá)細(xì)胞株HCC827/ER/ARL4C-OE及其空載對(duì)照細(xì)胞株HCC827/ER/Vector。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 MTS 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力及I C50將HCC8277和HCC827/ER細(xì)胞以5×103個(gè)/孔種植到96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加含不同濃度Erlotinib（0、100、200、400、800、1 600 nmol/L）的含血清RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。用20 μl MTS加100 μl含血清培養(yǎng)液，37℃孵育2 h，用僅含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作為背景消減，用BIO-RAD Model 680檢測(cè)490 nm的吸光度值。對(duì)加入0 nmol/L的Erlotinib對(duì)照細(xì)胞活性進(jìn)行歸一化檢測(cè)，IC50值用SPSS17.0軟件進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA 檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌、癌旁組織以及HCC827各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ARL4C的mRNA表達(dá)水平，按照說明書用RevertAid First Strand cDNA sythesis kit將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μl cDNA利用Lightcycler 480 SYBR Green I Master按照說明書進(jìn)行RT-qPCR，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 15 min；40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中：95℃ 15 s;55℃ 30 s;72℃ 1 s;40℃ 1 min;GAPDH作為內(nèi)參基因。ARL4C-F-primer:5’-CTACCGGCTCAAGTTCA ACG-3’，ARL4C-R-primer:5’-CGAGTCCACCA CGTAGATGA-3’；GAPDH-F-primer:5’-CCAG AACATCATCCCTGCCT-3’，GAPDH-R-primer:CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’，mRNA的相對(duì)定量用2-ΔΔCt法。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析和修正 以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)Ω骰虮磉_(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)以T27癌組織表達(dá)為準(zhǔn)，即它的表達(dá)量設(shè)為1，量化其他樣本的表達(dá)量；在調(diào)整基線循環(huán)和計(jì)算閾值后，采用2-ΔΔCt法比較ARL4C的相對(duì)表達(dá)量，儀器自動(dòng)根據(jù)得出的CT值（threshold cycle）運(yùn)用相對(duì)定量計(jì)算公式，ΔCtpatient=CtARL4C-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtpatient-ΔCt27，RQ值為2-ΔΔCt，計(jì)算得出代表相對(duì)表達(dá)量的RQ值，為了便于統(tǒng)計(jì)，把RQ值取常用對(duì)數(shù)進(jìn)行分析。

1.4.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞冰上裂解，超聲離心后取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。3%BSA封閉1 h后分別加入稀釋好的一抗4℃環(huán)境過夜，1×PBS洗滌4次，加入二抗封閉120 min，1×PBS洗滌3次后ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，分析灰度值。

1.4.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 把各細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升7×105個(gè)細(xì)胞，取100 μl接種于Transwell上室，下方用1 mg/ml的纖連蛋白進(jìn)行包被，下室用含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化吸引條件，把小室懸掛在24孔板中。37℃孵育48 h，上室細(xì)胞用棉簽擦除，小室用甲醇固定15 min晾干，用0.1%的結(jié)晶紫進(jìn)行染色。隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，倒置顯微鏡（×200）下觀察計(jì)數(shù)，以確定各組細(xì)胞的平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。配對(duì)資料比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；兩組間比較先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性分析，再進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)量資料以±s表示，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARL4C在非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中的表達(dá)

非小細(xì)胞肺癌組織中ARL4C的平均相對(duì)表達(dá)量lgRQ為0.0389±0.0617，而相應(yīng)癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量lgRQ為0.2445±0.0623，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0206），見圖1。

圖1 ARL4C在非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中的表達(dá)Figure 1 ARL4C expression in NSCLC and paracancerous tissues

2.2 ARL4C與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果表明，ARL4C mRNA的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及肺膜侵犯密切相關(guān)（P<0.05），而與腫瘤大小、性別、年齡、腫瘤位置及組織分型無明顯相關(guān)性（P>0.05），見表1。

2.3 ARL4C與EGFR基因突變的關(guān)系

63例非小細(xì)胞肺癌中，42例進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，其中EGFR基因突變組22例，EGFR野生型組20例。EGFR基因突變組，除常規(guī)突變外還包括1例T790M突變。EGFR基因突變組ARL4C mRNA的表達(dá)水平為-0.064±0.091，而EGFR野生型組表達(dá)水平為-0.0634±0.091，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.476）。結(jié)果表明，ARL4C mRNA表達(dá)水平與EGFR的突變狀態(tài)無顯著相關(guān)性。

2.4 ARL4C在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞株HCC827/ER中的表達(dá)

HCC827/ER細(xì)胞株中ARL4C mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別為HCC827細(xì)胞株的0.084和0.095倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001），見圖 2。

2.5 ARL4C在HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE細(xì)胞株中的表達(dá)

表1 ARL4C表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Association between ARL4C expression and clinicopathologic features of NSCLC patients

圖2 EGFR-TKI耐藥細(xì)胞株(HCC827/ER)中ARL4C mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)Figure 2 ARL4C mRNA(A) and protein(B) expression in EGFR-TKI-resistant cell line HCC827/ER

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，ARL4C在HCC827/ER/ARL4C-OE中mRNA和蛋白分別是HCC827/ER/Vector的58.28和11.89倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖3。

2.6 ARL4C過表達(dá)提高耐藥株HCC827/ER的藥物敏感度

圖3 ARL4C mRNA(A)和蛋白(B)在HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE細(xì)胞株中的表達(dá)Figure 3 ARL4C mRNA(A) and protein(B) expression in HCC827/ER/Vector and HCC827/ER/ARL4C-OE cell lines

MTS方法檢測(cè)結(jié)果顯示，HCC827/ER、HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE細(xì)胞的IC50分別為：1 849.7、1 714.4和464.1 nmol/L；HCC827/ER/ARL4C-OE在不同濃度的Erlotinib作用下，細(xì)胞活性相比于HCC827/ER/Vector顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

圖4 ARL4C過表達(dá)對(duì)耐藥株HCC827/ER細(xì)胞生長活性及耐藥敏感度的影響Figure 4 Effects of ARL4C overexpression on growth activity and drug resistance sensitivity of HCC827/ER cells

2.7 ARL4C過表達(dá)下調(diào)耐藥株HCC827/ER的遷移能力

結(jié)果顯示，穿過聚碳酸酯多孔濾膜的HCC827/ER、HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE細(xì)胞數(shù)量分別為：531.7±10.33、489.7±6.360和282.0±3.786個(gè)。與HCC827/ER/Vector細(xì)胞相比，HCC827/ER/ARL4C-OE細(xì)胞的遷移能力明顯降低（P<0.0001），見圖5。

圖5 ARL4C過表達(dá)對(duì)HCC827/ER細(xì)胞遷移能力的影響Figure 5 Effects of ARL4C overexpression on migration of HCC827/ER cells

3 討論

EGFR-TKI靶向治療是肺癌精準(zhǔn)治療的核心，能延長EGFR敏感突變非小細(xì)胞患者無進(jìn)展生存期（progression free survival,PFS），改善患者生活質(zhì)量[2]。EGFR-TKI獲得性耐藥是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者治療失敗的重要原因。因此闡明EGFR-TKI的耐藥機(jī)制、尋找新的藥物靶點(diǎn)、研發(fā)新的藥物成為臨床中亟待解決的問題。

目前，我們對(duì)EGFR-TKI耐藥分子機(jī)制的認(rèn)知研究還處于探索階段。已有的研究報(bào)道認(rèn)為可能與以下機(jī)制有關(guān)：（1）EGFR基因突變誘導(dǎo)的耐藥EGFR基因的敏感突變與耐藥突變共存，如20外顯子插入突變、T790M突變；（2）EGFR通路下游基因突變誘導(dǎo)的耐藥，如EGFRl通路下游KRAS、Braf、PIK3CA等發(fā)生突變[5-6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，EGFRTKI耐藥的發(fā)生率為5%～20%，遠(yuǎn)高于EGFR敏感突變合并上述耐藥突變的發(fā)生率，所以上述分子機(jī)制不能完全解釋EGFR-TKI耐藥的原因[7]。在前期工作中，通過分析文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)庫[8]，利用生物信息手段篩查出腫瘤相關(guān)的基因ARL4C。本研究結(jié)果顯示，ARL4C不僅與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征密切相關(guān)，而且對(duì)EGFR-TKI耐藥有重要調(diào)控作用。

研究顯示，高表達(dá)ARL4C可以抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移，但是對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖無影響，并且高表達(dá)ARL4C mRNA的卵巢癌患者具有良好的預(yù)后[4]。而關(guān)于結(jié)直腸癌和胃癌研究表明，ARL4C表達(dá)異常并參與腫瘤細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移[9-10]，本研究結(jié)果與前者相一致。本研究顯示，非小細(xì)胞肺癌組織ARL4C表達(dá)相比于癌旁組織下調(diào)（P<0.05）。進(jìn)一步臨床病理分析表明，ARL4C mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及肺膜侵犯密切相關(guān)（P<0.05）。結(jié)果表明，ARL4C在非小細(xì)胞肺癌中有抑癌基因作用。ARL4C在不同腫瘤中作用不同，表明腫瘤異質(zhì)性的特點(diǎn)。

qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株HCC827相比，EGFR-TKI耐藥的細(xì)胞株HCC827/ER中ARL4C表達(dá)顯著下調(diào)。MTS細(xì)胞活性檢測(cè)表明，與HCC827/ER/Vector相比，過表達(dá)ARL4C的HCC827/ER細(xì)胞株HCC827/ER/ARL4C-OEIC50由1 714.4 nmol/L下降至464.1 nmol/L。Transwell結(jié)果顯示，與HCC827/ER/Vector相比，HCC827/ER/ARL4C-OE細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱（P<0.05）。以上結(jié)果表明，過表達(dá)ARL4C能提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI藥物的敏感度并抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力。

EGFR 20號(hào)外顯子T790M位的突變是產(chǎn)生TKI獲得性耐藥的重要原因之一[11-12]。EGFR基因突變狀態(tài)與ARL4C表達(dá)相關(guān)性分析顯示，ARL4C mRNA表達(dá)水平與EGFR的突變狀態(tài)無顯著相關(guān)性。本研究中有1例EGFR T790M突變，其ARL4C表達(dá)水平為-0.148，低于非小細(xì)胞肺癌平均表達(dá)水平（0.0389）。ARL4C表達(dá)是否與EGFR T790M突變相關(guān)需要進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)進(jìn)行研究。

Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[13]，它和EGFR信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在交叉作用。相關(guān)研究顯示，在非小細(xì)胞肺癌中，EGFR基因突變伴隨著Wnt通路負(fù)調(diào)控因子的甲基化及β-catenin的過表達(dá)[14]。另有研究表明，ARL4C是Wnt/β-catenin和生長因子Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游靶標(biāo)，并且Wnt/β-catenin/Ras/ARL4C信號(hào)軸在發(fā)育性小管生成和腫瘤發(fā)生中均起著重要作用[4]。我們猜測(cè)，Wnt/β-catenin/Ras/ARL4C信號(hào)軸可能參與非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI的耐藥。

綜上所述，ARL4C在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和肺膜侵犯密切相關(guān)。過表達(dá)ARL4C能提高非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞HCC827/ER對(duì)EGFRTKI藥物的敏感度并抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲能力。ARL4C的表達(dá)可考慮作為判斷非小細(xì)胞肺癌惡性程度及EGFR-TKI敏感度的重要標(biāo)志物。