劉婷婷 呂宗德 李鳳玲 白夢茹

（南京市畜牧獸醫(yī)站，江蘇南京 210012）

H5亞型高致病性禽流感和H7N9一直威脅著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，為了更好地應(yīng)對疫情防控形勢，有效預(yù)防疫病的發(fā)生，國內(nèi)相關(guān)的強(qiáng)制免疫政策也在不斷地做出調(diào)整。2017年秋季開始，開始使用重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗，在H5亞型禽流感強(qiáng)制免疫的基礎(chǔ)上增加了H7亞型的強(qiáng)制免疫，2019年春季，又將重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1Re-8株+H7N9H7-Re1株）變更為重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗（H5N1Re-11株+Re-12株，H7N9H7-Re2株）（以下簡稱禽流感H5+H7三價苗）。本研究主要通過對蛋雞H5N1Re-11、H5N1Re-12、H7-Re2三種母源抗體的檢測及接種疫苗后免疫抗體水平的監(jiān)測，為禽流感H5+H7三價苗免疫程序的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

海蘭蛋雞400羽分兩組，其中200羽為母源抗體組，另外200羽為免疫組。母源抗體組在28日齡前不注射疫苗，也不使用任何藥物和添加劑；免疫組分別在15日齡、40日齡、80日齡、120日齡（開產(chǎn)前）、240日齡、360日齡采用禽流感H5+H7三價苗注射免疫，其中首免采用0.3ml頸部皮下注射，5周齡以后采用0.5ml胸部肌肉注射。

1.2 疫苗與檢測試劑

禽 流 感 病 毒H5亞 型（Re-11株）、H5亞 型（Re-12株）、H7亞型（H7-Re2株）血凝抑制試驗(yàn)抗原均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，批號均為2019004，有效期分別是 20210807、20210809、20210905。禽流感 H5+H7三價苗購自乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠，批號為獸藥臨字160132319。

1.3 樣品采集

母源抗體組分別在1日齡、7日齡、14日齡、21日齡及28日齡隨機(jī)采集20份血樣，每份血量不少于2ml，1日齡、7日齡時采用心臟采血，采血后的雞只淘汰，14日齡開始采用翅靜脈采血。

免疫組，根據(jù)免疫時間按一定的時間間隔進(jìn)行隨機(jī)采樣，每次20份，每份不少于2ml。

1.4 母源抗體監(jiān)測

分別對母源抗體組的5批樣品進(jìn)行禽流感病毒H5亞型（Re-11株）、H5亞型（Re-12株）、H7亞型（H7-Re2株）血凝抑制試驗(yàn)，該試驗(yàn)使用一次性96孔V型微量反應(yīng)板，具體操作方法按照國家標(biāo)準(zhǔn)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T18936-2003）進(jìn)行。檢測過程中分別設(shè)陽性對照、空白對照，并對配置的4單位病毒進(jìn)行回歸試驗(yàn)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按照≥4log2為合格。

1.5 免疫抗體監(jiān)測

免疫組分別在28日齡、35日齡、40日齡、47日齡、80日齡、120日齡、240日齡、360日齡及500日齡時采樣，進(jìn)行禽流感病毒H5亞型（Re-11株）、H5亞型（Re-12株）、H7亞型（H7-Re2株）的免疫抗體檢測。檢測方法同1.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 禽流感母源抗體的消長

試驗(yàn)結(jié)果表明，母源抗體組的H5（Re-11株、Re-12株）和H7亞型三種母源抗體的整體消長趨勢基本一致?？贵w效價均在1日齡時最高，之后隨著日齡的增長抗體效價逐漸下降。1-7日齡下降趨勢較緩，之后呈明顯下降趨勢，至14日齡，抗體效價平均值已降至4log2以下，28日齡母源抗體基本為零。此外，三種母源抗體的變異系數(shù)隨著日齡的增加逐漸增大。試驗(yàn)結(jié)果見表1，圖1。

表1 母源抗體組禽流感H5Re-11、H5Re-12和H7-Re2母源抗體消長

表2 免疫組禽流感H5Re-11、H5Re-12和H7-Re2免疫抗體水平

圖1

2.2 禽流感H5+H7三價苗免疫后抗體效價的走勢

免疫組于14日齡首免后，H5（Re-11株、Re-12株）和H7亞型三種免疫抗體效價的整體增長趨勢基本一致，隨著日齡的增加平均抗體效價逐漸提高。首免后14天，抗體效價提高并不顯著，21天時合格率才達(dá)標(biāo)，但平均抗體效價仍沒有達(dá)到很高水平。40日齡時二免，免疫1周后出現(xiàn)了抗體效價略微下降的趨勢，之后迅速上升并維持在一個較高水平。此外，隨著免疫抗體效價的提高，變異系數(shù)逐漸變小。試驗(yàn)結(jié)果見表2，圖2。

圖2

3 討論

3.1 母源抗體組

本試驗(yàn)中，母源抗體的消長規(guī)律表明，雛雞出殼后具有較高的抗體水平，足以保護(hù)雛雞抵抗禽流感病毒H5、H7亞型的侵襲。7日齡內(nèi)，母源抗體水平衰減速度緩慢，可能與體內(nèi)的卵黃囊可以繼續(xù)提供抗體有關(guān)[1]。7～14日齡，伴隨著卵黃囊的消失，體內(nèi)的母源抗體水平急劇下降[2]，至14日齡時，抗體效價已經(jīng)不能為雞群提供良好的保護(hù)力，在不免疫的狀態(tài)下，28日齡時，雞體內(nèi)的母源抗體基本消失。這為我們確定首免日齡提供了可靠的依據(jù)，海蘭蛋雞禽流感H5+H7三價苗的首免日齡不要太遲，最好控制在14日齡前后。

3.2 免疫組

雞群在14日齡首免，免疫14d后抗體效價有所提高，但是合格率達(dá)不到70%，免疫21天時才能夠提供較好的保護(hù)力。40日齡二免，二免后1周，抗體效價出現(xiàn)了一個短暫的下降，這主要是由于疫苗進(jìn)入雞體后會中和掉部分抗體[3]，在雞體抗體效價沒有達(dá)到較高水平時會呈現(xiàn)出一個略微的跌落。跌落之后，抗體效價呈現(xiàn)明顯上升趨勢，并一直維持在較高水平，而且變異系數(shù)也控制在很小的范圍內(nèi)。由此可見，該免疫程序的免疫效果良好，可以為雞群提供良好的保護(hù)力。唯一需要注意的是首免后免疫抗體水平增長緩慢、曲折，14日齡-28日齡前后以及二免后1周都屬于免疫保護(hù)力薄弱期，建議在此期間加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，控制好舍內(nèi)溫、濕度，盡可能避免疫病發(fā)生的各種風(fēng)險因素。