吳敬燚

摘 要：將蛹蟲草置于28℃下230rp/min搖床培養(yǎng)，發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，獲得其粗提物，采用薄層層析法（TLC）對(duì)提取物進(jìn)行初步的分離鑒定。

關(guān)鍵詞：液體深層發(fā)酵;代謝產(chǎn)物

蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）又名北冬蟲夏草，子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科、蟲草屬，是寄生在鱗翅目和鞘翅目等昆蟲蛹體上的真菌。蛹蟲草的藥用與保健價(jià)值和冬蟲夏草相似，為我國(guó)特有的一類珍貴藥用真菌，其主要成分蟲草素等含量遠(yuǎn)高于野生冬蟲夏草，而且比冬蟲夏草更易人工栽培，因此被選為冬蟲夏草的最佳替代品而進(jìn)行大量的人工培育。其生長(zhǎng)受到溫度、光照、培養(yǎng)基條件的影響。對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)的環(huán)境因子進(jìn)行研究，結(jié)果表明其適宜條件為生長(zhǎng)溫度為1～30℃，最適溫度為20℃，茵絲生長(zhǎng)的pH范圍是4.5～11.0，最適pH為7.0，菌絲生長(zhǎng)階段不需要光照。

蛹蟲草子實(shí)體的化學(xué)成分含有：麥角甾-4，6，8（14）一四烯-3一酮，檸檬甾二烯醇，二十四烷酸單甘油酯，麥角甾醇（4），麥角甾醇過氧化物，麥角甾-7，22一二烯-33，5，一三醇，蟲草素，腺苷，N一（2-羥乙基）腺苷。

對(duì)蛹蟲草次生代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律報(bào)道還較少，其作為冬蟲夏草的替代品，研究并發(fā)現(xiàn)其次生代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，有利于指導(dǎo)工業(yè)化的大生產(chǎn)，以滿足市場(chǎng)的需求。

1 器材和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

1.1.1 材料

蛹蟲草

1.1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、冷卻水循環(huán)裝置、循環(huán)水式多用真空泵、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、生化培養(yǎng)箱、水浴鍋、電子天平、高效薄層硅膠板

1.1.3 試劑

乙酸乙酯、無(wú)水硫酸鈉、蛋白胨、無(wú)水葡萄糖、展層劑、碘試劑、15%硫酸乙醇溶液。

1.1.4 常用培養(yǎng)基

固體平板活化培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L.（去皮，切成小塊煮沸20min，6層紗布過濾），葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，以水定容。

液體搖瓶培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L.（去皮，切成小塊煮沸20min，6層紗布過濾），葡萄糖20g/L，+1%蛋白胨

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲草菌種活化

1）配制PDA培養(yǎng)基100ml;

2）置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，121℃、30min;

3）每平板倒20ml培養(yǎng)基，倒5個(gè)培養(yǎng)基;

4）超凈工作臺(tái)接入蛹蟲草菌種;

5）平板置于生化培養(yǎng)箱中28℃活化，培養(yǎng)5-6天。

1.2.2 PDA液體培養(yǎng)基的配制

1）配制7.5LPDA培養(yǎng)基，加入1%蛋白胨，充分溶解后分裝于50個(gè)250ml三角瓶中，液體培養(yǎng)時(shí)裝液量為150ml/250ml;

2）置于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、30min滅菌;

1.2.3 接種、培養(yǎng)

1）為保證每瓶接入的菌種數(shù)量相等，于超凈工作臺(tái)上用已滅菌的膠頭滴管鈍端打孔;

2）用接種針往每瓶培養(yǎng)基接入一塊菌種;

3）將已接如菌種的培養(yǎng)基放入搖床中培養(yǎng)，28℃，230rpm。

1.2.4 過濾、萃取

1）取空白對(duì)照，即接入菌種的當(dāng)天做空白對(duì)照，之后每?jī)商烊∪颗囵B(yǎng)基，用三層紗布將其分別過濾，并將菌體放入稱量紙中放入烘箱中烘干;

2）發(fā)酵液裝進(jìn)經(jīng)清洗烘干的棕色試劑瓶中用等量乙酸乙酯混合萃，靜置2天，充分萃取。

1.2.5 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

1）經(jīng)分液漏斗分液之后有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉吸去殘留的水相，過濾。

2）蒸干乙酸乙酯，稱重。

1.2.6 層析

1）將萃取得到的物質(zhì)用甲醇溶解，濃度為5mg/ml;

2）用毛細(xì)管吸取樣品點(diǎn)到已活化的GF254高效薄層層析硅膠板上，點(diǎn)的直徑在2～3mm，距薄層一端距離為1cm左右，各樣品之間的距離一般也控制在1cm左右;

3）將薄層層析硅膠板放入已配制好的展層劑中，當(dāng)展層劑上行到距離硅膠板另一端1cm處時(shí)，取出硅膠板，待溶劑揮發(fā)干后于紫外燈下觀察結(jié)果;

4）將點(diǎn)過樣品薄層板放入碘缸，進(jìn)行碘染色;

5）顯色：將點(diǎn)過樣品的薄層板用鑷子直接浸入 15%硫酸乙醇溶液中，取出吹干后放置電爐上小火慢慢烘烤到呈明顯的斑點(diǎn)即可;

6）拍照并比較、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

在28℃，230rpm搖床培養(yǎng)下，蛹蟲草代謝產(chǎn)物的情況如下表1。

將上表按平均值與時(shí)間之間的關(guān)系制成曲線圖：

次生代謝產(chǎn)物經(jīng)薄層層析，顯色后，圖形如下：

從上圖可以看出蛹蟲草生長(zhǎng)過程的代謝物經(jīng)過薄層層析后在硅膠板上呈現(xiàn)出數(shù)量不同的條帶，表明在其生長(zhǎng)過程中其次生代謝產(chǎn)物的種類發(fā)生了變化。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，其次生代謝產(chǎn)物種類呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，且其重量也發(fā)生著變化，發(fā)酵到第十二天時(shí)其代謝產(chǎn)物種類最多，在硅膠板上呈現(xiàn)最多的條帶;之后其在硅膠板上呈現(xiàn)的條帶變化不明顯，表明其代謝產(chǎn)物基本不發(fā)生變化。

2.2 分析

蛹蟲草在其開始生長(zhǎng)階段1-2天中，其初生代謝產(chǎn)物不斷增加，因其在適應(yīng)期中細(xì)胞數(shù)沒有增加，但細(xì)胞內(nèi)的合成代謝十分活躍，表現(xiàn)為代謝產(chǎn)物總量不斷增加;接著細(xì)胞利用其數(shù)量較多的初生代謝產(chǎn)物合成次生代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)為代謝產(chǎn)物的總量下降，而代謝產(chǎn)物的種類上升;當(dāng)菌體生長(zhǎng)到一定階段，其代謝產(chǎn)物的種類達(dá)到最多（第12天）;隨后菌體產(chǎn)生一些新的代謝產(chǎn)物，而其總量卻下降了。

在蛹蟲草不斷生長(zhǎng)的過程中其生長(zhǎng)的環(huán)境不斷發(fā)生變化，由于培養(yǎng)基的內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的下降、通氣量的不足等原因使得蛹蟲草代謝產(chǎn)物的合成與分泌受到影響。

本實(shí)驗(yàn)探究了蛹蟲草生長(zhǎng)過程其代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，但其分泌的具體物質(zhì)及其含量還需進(jìn)一步研究。

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