林曉瑩 魏佳雪

(廣東省第二人民醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510317)

我國是出生缺陷高發(fā)國家，每年新增出生缺陷數(shù)約90萬例，其中出生時臨床明顯可見的出生缺陷約有25萬例[1]。同時，胎兒異常能在2%～5%的妊娠中被發(fā)現(xiàn)，且圍產(chǎn)期死亡例數(shù)的20%[2-5]。因此，產(chǎn)前診斷是防治出生缺陷的重要內(nèi)容。

出生缺陷病因包括環(huán)境因素和遺傳因素，根據(jù)《全球出生缺陷報告》，全球每年出生遺傳相關(guān)出生缺陷嬰兒近800萬，占出生總?cè)藬?shù)6%[6]。遺傳性病因可分為染色體病(含基因組病)、單基因病和多基因病，傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷的主要手段如血清學篩查、超聲檢查和染色體核型分析已滿足不了當前產(chǎn)前診斷發(fā)展的需要。近年來，產(chǎn)前分子診斷成為產(chǎn)前診斷的重要內(nèi)容，熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量 PCR 技術(shù)、多重連接依賴探針擴增技術(shù)和染色體芯片分析等已廣泛應用于產(chǎn)前診斷的臨床實踐中，并有相應的指南和應用專家共識[7,8]。表1為美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)和母胎醫(yī)學會(Society for Maternal-fetal Medicine，SMFM)對產(chǎn)前診斷檢測技術(shù)應用情況的總結(jié)[9]。

表1 ACOG和SMFM關(guān)于產(chǎn)前基因診斷檢測方法的總結(jié)

全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)是利用序列捕獲技術(shù)可以將人基因組的外顯子區(qū)域DNA捕獲并且富集雖然外顯子區(qū)域僅占全基因組1%～2%左右，卻包含了85%的致病變異，目前推薦用于兒科和成人醫(yī)學，例如有多個出生缺陷或神經(jīng)發(fā)育遲緩而其他檢測無法提供有效信息的臨床適應證。 產(chǎn)后診斷數(shù)據(jù)顯示W(wǎng)ES在疑似患有某種遺傳性疾病但未得到明確診斷的病例中的總體診斷率為25%～30%[10,11]。

然而，在實踐中，許多單基因疾病在宮內(nèi)會出現(xiàn)異常，這些異常能被超聲檢查發(fā)現(xiàn)，但核型和染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis, CMA)顯示為正常未得到明確診斷時，其中6.2%～80.0%可用WES發(fā)現(xiàn)其致病變異[12-14]，而檢出率的高低往往取決于臨床能提供給WES分析的信息。WES提供準確的產(chǎn)前診斷信息，有助于選擇妊娠結(jié)局、圍產(chǎn)期管理方式和判斷再發(fā)風險，做進一步的生殖指導等。

WES的應用可積極推動產(chǎn)前診斷的快速發(fā)展，但同時也面臨著挑戰(zhàn)和困難，因此本文將針對WES目前在產(chǎn)前診斷應用的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)進行探討，并對其發(fā)展方向進行展望。

1 WES在產(chǎn)前診斷中的應用優(yōu)勢

1.1 WES有助于提高產(chǎn)前診斷的診斷率 對于超聲檢查異常而核型和CMA結(jié)果正常的產(chǎn)前診斷病例中，WES往往能作為有效的補充手段，有效檢出致病變異，從而提高產(chǎn)前診斷的診斷率。Best[13]統(tǒng)計了截至2017年7月的WES的產(chǎn)前數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)WES總體診斷率在6.2%～80.0%，其中部分研究未在WES之前報告其有正常的核型或CMA結(jié)果，但在這些研究中，其診斷率也差異很大。這與Jelin等[15]統(tǒng)計的結(jié)果是一致的。WES的產(chǎn)前診斷率取決于提供分析的臨床提示和以下的多種因素，包括：單一與多器官系統(tǒng)受累，特定器官系統(tǒng)受累，先證者WES 與家系WES(即Trio WES)[12,16]。

1.2 WES有助于為患兒的早期診斷和胎兒宮內(nèi)治療提供有效信息 產(chǎn)前在明確診斷后對某些遺傳性疾病的胎兒可及時進行宮內(nèi)治療和對孕婦的分娩提前制定及采取合適的方案，以降低患兒的死亡率和患病率，從而更好地維護母嬰的健康。例如，產(chǎn)前診斷丙酮酸脫氫酶缺乏癥能使產(chǎn)后的及時治療成為可能，有助于改善妊娠結(jié)局[17-22]。

有研究發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)治療成骨不全癥(osteogenesis imperfecta，OI)胎兒的效果要比在出生后再進行間充質(zhì)干細胞移植治療效果好，可減少患兒預期骨折的發(fā)生率及其后遺癥[23]。很多OI病例是在妊娠期間發(fā)生新發(fā)突變，由于OI具有遺傳異質(zhì)性，因此WES能提供更加全面且快速的產(chǎn)前分子診斷，以便于提前進行宮內(nèi)干預。

此外，產(chǎn)前WES能為患兒提供額外和準確的預后信息，以評估宮內(nèi)手術(shù)的利弊，如在對嚴重腦室擴大的胎兒進行干預時應考慮是否要排除是否攜帶L1CAM突變[24]。

1.3 WES有助于人類胎兒發(fā)育的研究 由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)資助的幾個中心目前利用WES來鑒定新基因[25]。雖然大多數(shù)新基因主要是在產(chǎn)后檢測中被鑒定出來的，但與死胎或反復流產(chǎn)相關(guān)的，且需要通過產(chǎn)前WES或全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)來深入了解其功能的基因，也許對人類胎兒發(fā)展至關(guān)重要。

產(chǎn)前WES研究已成功識別以前未被識別的且與已知的孟德爾疾病基因相關(guān)的產(chǎn)前表型，以及鑒定新的人類發(fā)育障礙的候選基因，如KCTD1基因[26]。此外，產(chǎn)前WES研究有可能提高對致死性胎兒異常的遺傳性疾病的了解，通常這些疾病完整的表型是未知的，如KIF14基因的研究[27,28]。

因此，研究工作者和臨床實驗室建議產(chǎn)前WES的臨床信息數(shù)據(jù)庫需要建立并且共享[15]，以便于臨床的使用。

2 WES在產(chǎn)前診斷應用中的挑戰(zhàn)

2.1 WES的方法局限性 WES的方法局限性主要表現(xiàn)在：①相關(guān)基因覆蓋不全，例如HBB基因，其中一些致病變異發(fā)生在內(nèi)含子上，而WES未能覆蓋完全。這種情況需通過替代方法(如一代測序)進行補充，但由于產(chǎn)前所需的時間有限，這些替代方法并不總是可行。②WES對于重復序列和高GC含量的區(qū)域很難捕獲[29]。③對有假基因的或有高度同源基因家族的基因難以檢測，如HBA基因、IKBKG基因、CYP21A2基因等。④WES目前無法做到可靠地檢測所有類型的遺傳變異，如拷貝數(shù)變化、低水平鑲嵌現(xiàn)象、非整倍性、結(jié)構(gòu)染色體重排或三核苷酸重復，以及非編碼區(qū)域中的變異。因此，目前，常規(guī)測試如微陣列等仍應與產(chǎn)前WES同時考慮，特別是當臨床懷疑已知的遺傳性綜合征的產(chǎn)前表現(xiàn)時。

2.2 產(chǎn)前WES的遺傳咨詢 WES的遺傳咨詢在產(chǎn)前診斷中所面臨的困難要比在產(chǎn)后更為艱巨，因為產(chǎn)前診斷的結(jié)果往往影響著妊娠結(jié)局，這不僅會給孕婦及其家庭帶來重要影響，也關(guān)乎到胎兒的生命，尤其在我國目前醫(yī)患關(guān)系緊張的情景之下，如何對WES的結(jié)果進行正確地判讀得到明確診斷，如何將產(chǎn)前診斷結(jié)果清楚地解釋給孕婦及其家庭就顯得至關(guān)重要。

產(chǎn)前WES的遺傳咨詢所面臨的挑戰(zhàn)主要來源于3個方面：①胎兒表型信息的不確定性。首先，因超聲醫(yī)師水平差異，胎兒結(jié)構(gòu)異?？赡艹霈F(xiàn)過度診斷或漏診可能；再者，單基因病胎兒微妙表型異常在產(chǎn)前超聲中難以明確，且有一些遺傳性疾病可能存在不完全外顯、表型多樣性或者遲發(fā)等復雜的遺傳背景，且許多孟德爾遺傳病的表型還是無法通過超聲等手段觀察到，例如生長延緩、智力發(fā)育障礙等；此外，ClinVar數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) 和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Database，HGMD)(http:∥www.hgmd.org)等能給產(chǎn)后表型-基因型提供參考信息，也有相關(guān)文獻探討了這兩個數(shù)據(jù)庫的應用價值[30,31]。而目前尚未有類似的產(chǎn)前表型-基因型數(shù)據(jù)庫。②對變異的解讀，尤其是對臨床意義未明變異的解讀。美國醫(yī)學遺傳學和基因組學(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南明確將變異進行分類，并對其報告的原則和要求進行說明[32]。但在實踐工作中，醫(yī)院和第三方檢測機構(gòu)的實驗室是否都能嚴格按照ACMG指南要求進行解讀，分析人員水平的差異以及臨床醫(yī)生對遺傳學知識的掌握程度等都給臨床診斷及咨詢服務(wù)帶來挑戰(zhàn)。③對次要或偶然發(fā)現(xiàn)的處理。對于產(chǎn)后WES，ACMG建議臨床實驗室積極尋找并報告59個基因中的已知的致病變異和疑似致病變異，這些基因與腫瘤和心臟病的易感性有很大的關(guān)聯(lián)[33]，并且可在大約1%的人口中發(fā)現(xiàn)[34]。對于產(chǎn)前WES的次要發(fā)現(xiàn)，其具體實踐尚未找到相應的指南或準則。對于是否要報告次要發(fā)現(xiàn)或意外發(fā)現(xiàn)，建議要在檢測前知情同意中告知胎兒的父母，這與大多數(shù)專家的意見也是一致的[35]。

2.3 WES在產(chǎn)前診斷應用的社會倫理學問題 產(chǎn)前WES引起的社會倫理學問題一直備受關(guān)注且有爭議[35]。首先，產(chǎn)前診斷本身就否定了胎兒作為一個生命的自主權(quán)[36]；其次，基于產(chǎn)前診斷信息，父母有可能選擇終止妊娠或是產(chǎn)后有不對等的撫養(yǎng)方式，這都有可能給父母和孩子帶來沉重的心理負擔[37]，因此必須仔細權(quán)衡這其中的利弊。此外，對于次要或偶然發(fā)現(xiàn)，尤其是出現(xiàn)非親子或非倫理父母血緣關(guān)系的意外問題，母親需要單獨接受咨詢，且有做出是否報告的選擇權(quán)。

2.4 WES在產(chǎn)前診斷應用的費用 目前，目標區(qū)域檢測、WES和WGS都是依靠第一代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)平臺發(fā)展的產(chǎn)物，它們的區(qū)別在于覆蓋的基因數(shù)和區(qū)域有所不同，例如目標區(qū)域檢測多是把同一疾病或同一系列疾病相關(guān)的基因組合在一起，往往包括幾個至上百個基因；WES覆蓋了人類基因組2萬多個基因的外顯子區(qū)域；而WGS則是覆蓋了人類基因組所有已知或未知基因的外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)。隨著測序成本的降低，目標區(qū)域檢測，WES和WGS的成本差異主要在于對變異分析的成本，包括分析團隊的人力成本、數(shù)據(jù)處理及儲存的成本和分析所需的時間成本。因此，目標區(qū)域檢測成本收費較低，WES次之，WGS難度最大，價格也就越高。

對于產(chǎn)前診斷，相比目標區(qū)域檢測和WGS，Trio WES是較為全面且經(jīng)濟快速的檢測方法。目前對于產(chǎn)前WES的經(jīng)濟效益尚未得到正式地評估，但從產(chǎn)后大規(guī)模樣本來看，WES的應用更有利于節(jié)省醫(yī)療費用[38]。

3 WES的未來發(fā)展方向

隨著技術(shù)不斷改進，測序成本的降低和生物信息分析能力的優(yōu)化，WGS的應用是勢必發(fā)展的。目前，也有不少在臨床應用WGS的報道[39-41。然而，WGS覆蓋的范圍比WES更廣，所能挖掘的信息更多，這比WES的應用需要面臨更多的困難，尤其在解讀咨詢上，因此這也限制了WGS目前的廣泛應用。

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)是利用母體外周血漿中胎兒游離DNA進行分析的一種檢測方法，目前多應用于篩查胎兒21、18、13-三倍體的非整倍體異常，也能檢測出一些單基因遺傳病[42]。在技術(shù)層面上，利用母體外周血漿中胎兒游離DNA進行WES或WGS檢測是可以實現(xiàn)的，但不成熟，仍需要解決如WGS可能出現(xiàn)覆蓋不全、假陽性率和假陰性率高、需要排除胎盤嵌合等問題[43]。

單細胞測序允許對單個細胞進行特異性分析，單細胞的WES和WGS測序也早有報道，多應用于植入前診斷中對非整倍體、拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)和某些單基因疾病的檢測[44]。采用胎盤不同位置的多個細胞進行單細胞測序分析有助于排除母體污染或胎盤嵌合的問題，在產(chǎn)前診斷中的應用有很大的潛力。

綜上所述，在超聲檢查異常而核型和CMA分析結(jié)果正常的胎兒中，WES能提高其產(chǎn)前診斷率，且其診斷范圍增加且分散，極大提高罕見病檢出率。2018年發(fā)表的關(guān)于使用全基因組測序進行胎兒診斷的聯(lián)合立場聲明及2020年1月發(fā)表的ACMG對胎兒外顯子測序(exome sequencing，ES)在產(chǎn)前診斷中應用的意見中均已提出在胎兒超聲異常，但核型及CMA正常的情況下可采用測序進行檢測[45,46]。但是，WES的應用同時帶來一系列挑戰(zhàn)，包括技術(shù)、應用、倫理、經(jīng)濟等，仍不建議常規(guī)使用WES進行產(chǎn)前診斷[45,47]，需進一步證實技術(shù)可行性及臨床效力。