周永強 易國蓮 王宇婷 葉 蘭 王小雪 趙春麗*

（貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽550025）

植物內(nèi)生真菌是一類存在植物的組織中以細胞內(nèi)或細胞間的方式生長，而不會對它們造成任何有害影響的微生物[1]。在長期的自然選擇下與宿主植物形成和諧的共生關(guān)系，“內(nèi)共生理論”認(rèn)為植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的物質(zhì)[2]，并且植物內(nèi)生真菌是一個種類多、分布廣的生物類群，具有極其豐富的種屬多樣性和功能多樣性，同一種植物或是同一株植物中可以分離出多個不同種屬的內(nèi)生真菌[3]。從內(nèi)生真菌中尋找和發(fā)掘人類可利用的資源，不僅對人類社會的健康發(fā)展也對自然生態(tài)保護有著十分重大的意義。

小花清風(fēng)藤（Sabia parviflora Wall. ex Roxb.）是一種來自被子植物門雙子葉植物綱無患子目清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬的常綠木本藤本植物的干燥莖和葉。它的根、莖、葉皆可以用作藥物，在貴州西南部常用于治療黃疸型肝炎和風(fēng)濕性疼痛，療效好，具有很高的藥用價值。此外，小花清風(fēng)藤具有許多生物活性，因此對它的開發(fā)利用極為重要[4]。然而，由于開荒導(dǎo)致小花清風(fēng)藤資源日益匱乏，滿足不了市場需求，因此尋找能夠替代宿主植物產(chǎn)生藥效成分的內(nèi)生真菌意義重大。最近研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌可以促進寄主植物的生長和抗逆性，產(chǎn)生多種與寄主植物相同或相似的二次代謝產(chǎn)物，是影響藥材真實性的關(guān)鍵因素[5-7]。對從小花清風(fēng)藤莖中篩選出內(nèi)生真菌進行類群分析，通過研究內(nèi)生真菌的多樣性，或可找到與宿主具有相同的或含有相似活性成分（如抗病毒性肝炎成分等）的菌株，并可發(fā)現(xiàn)許多擁有抗人類疾病活性的藥物能應(yīng)用于醫(yī)藥業(yè)行業(yè)中，可用于開發(fā)和利用。

1 材料

1.1 供試菌株

小花清風(fēng)藤內(nèi)生真菌菌株L-43 是從小花清風(fēng)藤葉中分離得到，保存在在貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥實驗室。

1.2 主要試劑

Tris 飽和酚購于北京索萊寶科技有限公司；EDTA-2Na 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇購于天津市富宇精細化工有限公司；引物V9D 和引物L(fēng)S266 均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；NaCl 購于成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器

基因擴增儀（JY-96G）購自君意電泳公司；振蕩培養(yǎng)箱（BS-1EA）常州市華普達儀器有限公司；雙面單人凈化工作（SW-CJ-2FD）購自浙江蘇凈凈化有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器（DS-280KB30）購自上海申安醫(yī)療器械廠。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌L-43 的形態(tài)學(xué)鑒定

從斜面挑取各真菌，分別接種于培養(yǎng)基上，使用恒溫培養(yǎng)箱在28℃下培育。按照菌落和菌絲的形態(tài)特點進行歸類與鑒別，觀察其菌落大小、顏色、表面特征、質(zhì)地等。無菌條件下在培養(yǎng)基上以45°角插入2 片蓋玻片，并用接種針從斜面挑取少量菌絲接種，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用光學(xué)顯微鏡觀察各菌落和菌絲，是否有孢子及分生孢子梗，對照《真菌鑒定手冊》進行形態(tài)學(xué)鑒定[8]。

2.2 內(nèi)生真菌L-43 的分子鑒定

將在無菌條件下，將純化好的小花清風(fēng)藤葉內(nèi)生真菌L-43接于PDB 培養(yǎng)基中，在150rpm 搖床培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)4-5 天后，過濾，并用無菌水沖洗獲得菌體。放入研缽，加入液氮研磨成粉，加入DNA 提取試劑進行提取，采用引物V9D 和LS266 對提取后的DNA 進行ITS 序列擴增，擴增后將PCR 擴增片段進行測序。結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫BIAST 對比已知種屬的ITS序列進行相似性分析，再運用MEGA5.0 分析其系統(tǒng)發(fā)育，構(gòu)建進化樹，而后進行數(shù)據(jù)處理和生物多樣性分析[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 小花清風(fēng)藤葉內(nèi)生真菌L-43 的形態(tài)學(xué)

菌株L-43 在PDA 平板生長7 d 時，單菌落表面不平，表面蓬松，菌絲絲絨狀，菌落中間灰色，外圍白色，無滲出液。主要顯微形態(tài)特征菌絲較細，鏈狀，直或彎曲，有分支，分生孢子單生、呈梨形，分隔明顯且無規(guī)律。根據(jù)菌株L-43 的形態(tài)學(xué)特征將其鑒定為Alternaria tenuissima（鏈格孢屬）（圖1）。

3.2 小花清風(fēng)藤葉內(nèi)生真菌L-43 分子鑒定

內(nèi)生真菌L-43 經(jīng)ITS 區(qū)經(jīng)引物V9D 和LS266 擴增、PCR產(chǎn)物測序得到934 bp 的rDNA 序列。將所測內(nèi)生真菌L-43 的擴增產(chǎn)物序列輸入NCBI 中進行Blast 序列比對分析，篩選出與內(nèi)生真菌L-43 種屬最相似的序列，并用MEGA5.05 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，在進化樹中，內(nèi)生真菌L-43 與Alternaria tenuissima KJ082100 聚類在同一分支（圖2），親緣關(guān)系最為接近，結(jié)合在GenBank 中登錄結(jié)果顯示二者相似度為100%，同時，結(jié)合L-43 的形態(tài)學(xué)特征，最終將菌株L-43 鑒定為Alternaria tenuissima（鏈格孢屬）。

圖2 菌L-43 的ITS 系統(tǒng)進化樹

4 討論

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子生物學(xué)鑒定后為一個種屬的的幾種菌出現(xiàn)了生長形態(tài)和顯微形態(tài)不同的情況，此種情況該以形態(tài)學(xué)鑒定為主還是以分子生物學(xué)為主。有學(xué)者認(rèn)為，此種情況該一分子生物學(xué)鑒定結(jié)果來判斷其種屬。內(nèi)生真菌的形態(tài)易受溫度、時間、培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件的影響，從而導(dǎo)致其鑒定結(jié)果的影響；分子生物學(xué)鑒定及反映了內(nèi)生真菌的分類地位，又反映了其進化水平和與其他生物的親緣關(guān)系[10]。

總之，本研究首次從苗藥小花清風(fēng)藤的葉中分離得到內(nèi)生真菌L-43，并采用形態(tài)學(xué)及分子鑒定方法將其鑒定為Alternaria tenuissima（鏈格孢屬）。針對這類內(nèi)生真菌我們將進行大批量發(fā)酵，對其發(fā)酵代謝產(chǎn)物進一步篩選其生物活性，以期從其發(fā)酵液中獲得有效的生物活性物質(zhì)。