王先挺， 曾立紅， 王 斌， 張曉萌， 俞賢瓊

(寧波市鄞州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站， 浙江 寧波 315100)

近10年來(lái)，寧波市試驗(yàn)推廣哈密瓜型甜瓜種植，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益，并已形成一定的產(chǎn)業(yè)，全市春季種植總面積為0.1萬(wàn)hm2以上，單季產(chǎn)值1.2億～1.5億元。甜瓜的主要病害是蔓枯病，2012年后甜瓜枯萎病的發(fā)生日益嚴(yán)重，嚴(yán)重年份發(fā)病率達(dá)30%～50%，直接影響甜瓜的產(chǎn)量和質(zhì)量，給生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。甜瓜枯萎病在整個(gè)生長(zhǎng)周期都可發(fā)病，以開(kāi)花期、坐果期和果實(shí)膨大期3個(gè)階段為高發(fā)期，發(fā)病初期可有1～2枝蔓失水萎蔫，隨后根莖腐朽變褐色，引起整株萎蔫枯死。抽樣調(diào)查顯示，寧波地區(qū)大棚種植地塊甜瓜枯萎病的平均發(fā)病率在40%以上，主要發(fā)生在開(kāi)花坐果以后，特別是在持續(xù)多日陰雨天轉(zhuǎn)晴，大棚內(nèi)溫濕度驟然升高，不及時(shí)降溫降濕的情況下更易發(fā)生。發(fā)病初期，葉片從基部開(kāi)始逐漸向上萎蔫，中午明顯，早晚恢復(fù)正常，幾天后葉片全部凋萎，根莖部縊縮，維管束變褐，整株枯死。

枯萎病是制約農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的一種世界性土傳真菌病害，嚴(yán)重危害棉花、甘蔗、香蕉、番茄、瓜類(lèi)、四季豆及辣椒等[1-2]經(jīng)濟(jì)作物。尖孢鐮刀菌甜瓜專(zhuān)化型(Fusariumoxysporumf.sp.melonisW.C. Snyder &H.N. Hans)是甜瓜枯萎病主要病原菌，其病原菌菌絲和孢子可在土壤或未腐熟肥料中存活，從根部傷口或根尖組織侵染植物組織，在植株體內(nèi)定殖[3]。目前，國(guó)際上已經(jīng)鑒定出4種甜瓜專(zhuān)化型枯萎病生理小種，而且不同地區(qū)甜瓜專(zhuān)化型生理小種的分布存在差異[4]；楊來(lái)新等[5]研究表明，甜瓜根腐病與枯萎病病原菌發(fā)病癥狀及病原形態(tài)相似。明確病原菌的種類(lèi)及其生物學(xué)特性是進(jìn)行病害防治的基礎(chǔ)，但是目前尚未見(jiàn)有關(guān)寧波地區(qū)甜瓜枯萎病病原菌的研究報(bào)道。因此，以寧波大棚典型甜瓜枯萎病病株為試材，采用組織分離法結(jié)合科赫氏法則 (Koch’s postulates)、形態(tài)學(xué)觀察及rDNA-ITS區(qū)序列檢測(cè)等方法，研究甜瓜枯萎病病原及其生物學(xué)特性，以期為甜瓜枯萎病的預(yù)防與防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病植株 新發(fā)病的甜瓜枯萎病病株，采自寧波市鄞州區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地甜瓜大棚。

1.1.2 試劑 0.1%升汞，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉，L-酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、硝酸鈉、L-谷氨酰胺、L-絲氨酸、L-白氨酸和L-天冬氨酸、(0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液、0.05 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L NaOH緩沖液，SDS購(gòu)于上海生工生物公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱，離心機(jī)，Mastercyclerpro 銀制梯度 PCR擴(kuò)增儀。

1.1.4 其他 甜瓜種子，品種為紅妃哈密瓜，上海菲托種子有限公司；培養(yǎng)土，購(gòu)于花圣園藝科技公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 2015年5月12日從寧波市鄞州區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地甜瓜大棚采集試樣用于分離枯萎病病菌。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該基地2012年甜瓜枯萎病平均發(fā)病率17.9%，2015年為31.6%。參照文獻(xiàn)[6]的方法，采集新發(fā)病的甜瓜枯萎病病株，取病株莖段病健組織交界處上方5 cm取樣，經(jīng)自來(lái)水沖洗，切成5 mm左右長(zhǎng)度，用0.1%升汞表面消毒3 min，無(wú)菌水沖洗3遍，然后將組織塊置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，待組織塊周?chē)L(zhǎng)出菌絲時(shí)，挑取邊緣單根菌絲轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，即獲得純分離菌株。

1.2.2 病原菌致病性檢測(cè) 采用蘸根法、浸種法、澆根法和菌絲塊接莖基部法接種病菌，以空白處理為對(duì)照，每個(gè)處理接種10株甜瓜，3次重復(fù)。操作步驟： 1) 將分離所得的真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用滅菌水洗下分生孢子，顯微計(jì)數(shù)檢測(cè)孢子濃度，分別制成5×105個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。2) 空白對(duì)照處理，將培養(yǎng)土滅菌后裝入預(yù)先消毒的直徑為15 cm的花盆中澆水備用。將甜瓜種子在清水中浸泡12～14 h，挑選露嘴的種子插入培養(yǎng)土中(大約1/3)，每盆5粒，在25～30℃的溫室內(nèi)正常培育管理，觀察病情。3) 蘸根法，挖取盆中子葉完全展開(kāi)的甜瓜幼苗，洗凈其根部，采用浸根接種法接菌[7]，即將其根系浸入孢子懸浮液中10 min，以無(wú)菌水浸根作對(duì)照。接菌后的幼苗定植于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，在溫室內(nèi)正常管理，觀察病情。4) 浸種法，將種子浸泡到孢子懸浮液種12～14 h，挑選露嘴的種子插入(大約1/3)到培養(yǎng)土中，其他同空白對(duì)照。5) 澆根法，當(dāng)盆中甜瓜幼苗真葉完全展開(kāi)時(shí)，用5×105個(gè)/mL的孢子懸浮液滴澆甜瓜幼苗根部，每株滴澆1 mL，其他同空白對(duì)照。6) 菌絲塊接莖基部法，當(dāng)盆中甜瓜幼苗子葉完全展開(kāi)時(shí)，切取3 mm×3 mm的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的病原菌菌絲塊和分生孢子(培養(yǎng)基一同切取)，粘帖在離培養(yǎng)土1 cm左右的甜瓜幼苗莖基部，3 d后去掉菌絲塊，其他同空白對(duì)照。選取回接試驗(yàn)顯示萎焉癥狀的植株離培養(yǎng)土5～10 cm主莖，菌絲塊接莖基部法離病部5～10 cm主莖再作分離，分離到的真菌參照BOOTH[8]的方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

1.2.3 病原菌鑒定

1) 形態(tài)學(xué)鑒定。將供試菌株和經(jīng)致病性測(cè)定后再分離獲得的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃、12 h光照/12 h黑暗恒溫培養(yǎng)4 d后觀察菌落培養(yǎng)性狀，測(cè)量菌落大小，待產(chǎn)孢后，通過(guò)制玻片、顯微鏡觀察病原菌分生孢子形態(tài)特征。根據(jù)病菌生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)特征和產(chǎn)孢特征，查閱真菌分類(lèi)資料確定病原菌種類(lèi)。

2) 分子生物學(xué)鑒定。采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)待鑒定菌株，收集菌絲體，采用SDS法提取菌體基因組DNA[9]。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA分子的大小、完整性及電泳條帶的清晰度。DNA樣品在-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后，擴(kuò)增檢測(cè)基因組PCR。采用ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG

G-3′和ITS4 5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC -3′對(duì)提取的真菌基因組全長(zhǎng)ITS區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR退火溫度58℃。將擴(kuò)增出來(lái)的目的核酸片段送杭州華大基因生物工程有限公司純化后進(jìn)行測(cè)序。采用MEGA 4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將核酸片段測(cè)序結(jié)果提交NCBI的GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似度高的序列和一外族序列作為構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的序列；采用ClusterX進(jìn)行比對(duì)分析，將比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入MEGA 4中，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定 考察不同碳源、氮源、生長(zhǎng)溫度和pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響及病原菌的致死條件。將回接分離確定的病原菌代表性菌株在PDA平板上28℃培養(yǎng)3 d，用滅菌的內(nèi)徑5 mm的打孔器切取菌落邊緣菌餅，分別移至不同培養(yǎng)基中央，28℃黑暗培養(yǎng)3 d。3次重復(fù)，3 d后用直尺測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑。

1) 碳源。設(shè)5個(gè)處理，以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉等為碳源，基本培養(yǎng)基為PDA，其他處理則將PDA中的葡萄糖替換成相同濃度的其他碳源。

2) 氮源。設(shè)8個(gè)處理，以L-酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、硝酸鈉、L-谷氨酰胺、L-絲氨酸、L-白氨酸和L-天冬氨酸等為氮源，基本培養(yǎng)基為蔡氏培養(yǎng)基，其他處理則將蔡氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉轉(zhuǎn)換成相同濃度的其他氮源。

3) pH。設(shè)8個(gè)處理，用磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液和0.05 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L NaOH緩沖液)將滅菌的PDA培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0。

4) 生長(zhǎng)溫度。設(shè)8個(gè)處理，試驗(yàn)溫度為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃和35℃，培養(yǎng)基為PDA，分別置于不同溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

5) 致死條件。將經(jīng)致病性測(cè)定后再分離獲得的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用滅菌水洗下分生孢子制成濃度為4.6×104個(gè)/mL的孢子懸浮液，分別裝在無(wú)菌的10 mL離心管內(nèi)，在46℃、48℃、50℃和52℃的水浴鍋中處理10 min，再用移液槍吸取100 μL分別涂布在PDA培養(yǎng)基上，于28℃黑暗培養(yǎng)3 d，3次重復(fù)，3 d后測(cè)量生長(zhǎng)情況和菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0進(jìn)行方差分析和多重比較(Duncan法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜枯萎病菌的分離及其致病性

從甜瓜病株莖蔓組織中分離獲得1株真菌，將分離到的菌株采用蘸根法、浸種法、澆根法和菌絲塊接莖基部法回接至健康甜瓜苗上，其發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀基本一致(圖1)。其中，蘸根法，病菌回接10 d，2株甜瓜出現(xiàn)輕微萎焉癥狀，15 d時(shí)有5株甜瓜出現(xiàn)明顯萎焉癥狀，21 d共有21株甜瓜出現(xiàn)萎焉癥狀，回接發(fā)病率為70.0%。菌絲塊接莖基部法，病菌回接5 d后有12株甜瓜莖部出現(xiàn)病斑，15 d時(shí)病斑擴(kuò)大并且明顯溢縮，病部長(zhǎng)灰白色菌絲體和分生孢子，21 d時(shí)共有22株甜瓜出現(xiàn)萎焉癥狀，回接發(fā)病率為73.3%。浸種法，病菌回接10 d時(shí)有3株甜瓜在下部葉上出現(xiàn)輕微萎焉癥狀，上部葉仍然正常，21 d時(shí)共有11株甜瓜的下部葉出現(xiàn)明顯枯萎癥狀，回接發(fā)病率為36.7%。澆根法，回接發(fā)病癥狀同浸種子法一致，回接發(fā)病率為33.3%。從所有回接試驗(yàn)中采集顯示枯萎癥狀的植株，在其離培養(yǎng)土5～10 cm的主莖中均再次分離到相同的真菌菌株。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 分離獲得的真菌經(jīng)25℃培養(yǎng)4 d后，在PDA培養(yǎng)基上形成直徑為41.3 mm的菌落，并產(chǎn)生大量的小型分生孢子，未見(jiàn)大型分生孢子；培養(yǎng)10 d后，偶見(jiàn)大型分生孢子。小型分生孢子從單個(gè)瓶狀小梗上產(chǎn)生，粘附在一起，不鏈生。單孢，橢圓或略彎，大小為(2.9～3.4)μm×(3.5～7.4)μm；1個(gè)分隔的大小為(3.0～3.3)μm×(3.5～8.2)μm(圖2)。大型分生孢子著生在單瓶梗上，多數(shù)2～3個(gè)分隔；2個(gè)分隔的大小為(4.3～6.4)μm×(22.6～31.0)μm；3個(gè)分隔的大小為(4.8～6.4)μm×(16.0～35.4)μm。參照BOOTH[8]的鐮刀菌專(zhuān)著(The Genus Fusarium)，初步鑒定寧波甜瓜枯萎病的病原為Fusariumoxysporum。

2.2.2 分子鑒定 使用ITS1和ITS4引物對(duì)病原菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序獲得455 bp大小的PCR片段。使用Clustalx和MEGA 4生物信息軟件以Neighbor-Joining方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，該片段DNA序列與鐮刀菌Fusariumoxyspor-umstrain A0654 ITS區(qū)段相似性高達(dá)98%(圖3)，二者處于同一分支，同源性很高。

2.3 鐮刀菌的生物學(xué)特性

2.3.1 碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 從表1看出，碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)(菌落直徑)的影響差異顯著，不同碳源病原菌的菌落直徑為葡萄糖>蔗糖>α-乳糖=可溶性淀粉>麥芽糖。其中，葡萄糖為最佳碳源，其菌落直徑最大，為38.3 mm，極顯著高于其余碳源；蔗糖其次，菌落直徑為34.7 mm，與其他碳源差異顯著；其余碳源間差異不顯著。

表1 不同碳源處理病原菌的菌落直徑

2.3.2 氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 從表2看出，氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)(菌落直徑)的影響差異顯著，不同氮源病原菌的菌落直徑為硝酸鈉>甘氨酸>白氨酸=酪氨酸>脯氨酸>谷氨酰胺>絲氨酸>天冬酰胺。其中，硝酸鈉為最佳氮源，其菌落直徑為40.3 mm，與甘氨酸差異顯著，極顯著高于其余氮源；甘氨酸其次，其菌落直徑為37.3 mm，顯著高于脯氨酸，極顯著高于谷氨酰胺、絲氨酸和天冬酰胺，與其余氮源差異不顯著；白氨酸、酪氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺間差異不顯著，但均極顯著高于絲氨酸和天冬酰胺。

表2 不同氮源處理病原菌的菌落直徑

2.3.3 溫度與pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 從圖4看出，隨著培養(yǎng)溫度和pH升高，菌落直徑分別呈先增后減和先增后減再增再減趨勢(shì)，溫度和pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)(菌落直徑)的影響存在差異。其中，病原菌在15～35℃均能生長(zhǎng)，25℃生長(zhǎng)最佳，25℃菌落直徑最大，為41.7 mm，顯著高于其余溫度；25～30℃生長(zhǎng)較好，菌落直徑顯著高于其余溫度；溫度大于30℃生長(zhǎng)受到明顯抑制。病原菌對(duì)pH改變有較強(qiáng)的耐受性，在培養(yǎng)基pH 5.0～10.0均生長(zhǎng)較好，且菌落大小無(wú)顯著差異(pH 8除外)；培養(yǎng)基pH為4時(shí)，病原菌生長(zhǎng)受到顯著抑制。

2.4 病原菌的致死條件

試驗(yàn)結(jié)果顯示，病原菌孢子在46℃和48℃處理10 min后仍存活且在培養(yǎng)基上形成大量菌落；50℃處理后僅觀察到少量的小菌落形成；52℃處理后未形成菌落。表明，該病原菌分生孢子的致死條件為52℃ 10 min。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，寧波春季大棚甜瓜枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，與邵元健等[10]的研究一致，但與康鋒等[11]報(bào)道的新疆甜瓜枯萎病病原菌為腐皮鐮孢菌〔Fusariumsolani(Mart.) Sacc.〕不同?？梢?jiàn)，不同地區(qū)甜瓜枯萎病的病原種類(lèi)、致病機(jī)理存在一定差異。已報(bào)道的甜瓜枯萎病菌的生理小種有4個(gè)，分別為小種0、1、2和1.2[12]。總體上，具有地區(qū)針對(duì)性的枯萎病病原篩選和鑒定工作對(duì)于當(dāng)?shù)靥鸸峡菸“l(fā)生的防治具有重要指導(dǎo)意義。寧波春季大棚甜瓜枯萎病病原菌的生理小種有待進(jìn)一步探明。

研究表明，葡萄糖和蔗糖、硝酸鈉和甘氨酸分別為該菌生長(zhǎng)的較好碳源和氮源；病原菌在15～35℃均能生長(zhǎng)，25～30℃生長(zhǎng)較好，25℃生長(zhǎng)最佳；病原菌對(duì)pH變化有很強(qiáng)的適應(yīng)性，在pH 5.0～10.0均生長(zhǎng)良好，表明，改變土壤pH并不能有效遏制該病原菌生長(zhǎng)。病菌分生孢子的致死溫度為52℃ 10 min，與前期在西瓜枯萎病菌上的報(bào)道類(lèi)似[13]，同時(shí)一定程度上證明南方伏天灌水覆單層白膜提高大棚溫度能夠有效防治大棚甜瓜枯萎病的發(fā)生。

試驗(yàn)結(jié)果表明，蘸根法、浸種法、澆根法和菌絲塊接莖基部法均能導(dǎo)致發(fā)病，蘸根法和菌絲塊接莖基部法發(fā)病率高，回接發(fā)病率分別為70.0%和73.3%；浸種子法和澆根法的回接發(fā)病癥狀不典型，只在下部葉上出現(xiàn)枯萎癥狀，上部葉仍然正常，但是再次分離發(fā)病病株莖仍能得到相同的鐮孢菌。表明，種子帶菌可以作為病害的初侵染來(lái)源，病菌可以通過(guò)胚根侵染發(fā)芽的種子，與前人的研究結(jié)果一致[14]。