劉 煒 ，劉 行 ，楊曉鳳 ，尹 全 ，毛建霏 ，張義蓉 ，陳龍飛

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川成都610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，四川成都610300）

春雷霉素是放線菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，屬氨基糖苷類抗菌素，分子式為C14H25N3O9[1]，1963 年從日本奈良縣春日神社的土壤中分離出第一株鏈霉菌，我國的春雷霉素產(chǎn)生菌是1964 年在江西土壤中分離出的小金色鏈霉菌[2-3]。春雷霉素是農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)兩用抗生素類殺菌劑，具有較強(qiáng)的滲透性和內(nèi)吸性[4]，主要是通過抑制病菌菌體的蛋白質(zhì)合成，抑制菌絲伸長并導(dǎo)致細(xì)胞顆?；蓴_病菌在農(nóng)作物植株內(nèi)生長繁殖，從而達(dá)到防治病害的目的，對防治西瓜、黃瓜、桃、番茄、馬鈴薯、水稻等多種農(nóng)作物的細(xì)菌、真菌病害有效[5-7]，作為高效、廣譜、低毒、無公害生物農(nóng)藥，急性毒性較低，是較理想的殺菌劑。日本和歐盟規(guī)定春雷霉素在水果中最大殘留限量值均為0.2 mg/kg[8]。

春雷霉素因具有極性強(qiáng)、在水中溶解度大、無紫外吸收特性，在液相色譜柱上保留能力弱，與雜質(zhì)不能完全分離，分析檢測難度大[9]。目前，春雷霉素的檢測方法還沒有國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，雖然在水、土壤、黃瓜、糙米、農(nóng)藥制劑等樣品中春雷霉素的檢測方法[10-17]已有相關(guān)文獻(xiàn)，但在桃中春雷霉素的殘留分析方法尚未見報道。

本研究以桃為試驗(yàn)對象，建立了超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜測定桃中春雷霉素殘留的分析方法，可滿足桃中春雷霉素殘留的檢測要求，為春雷霉素的科學(xué)使用以及在食品中的殘留分析和風(fēng)險評估提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試桃購買于農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試劑

春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，德國Dr. E 公司）；甲醇、乙腈（LCMS 級，德國 Merck 公司）；甲酸（HPLC 級，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；氯化鈉（分析純，四川西隴化工有限公司）；超純水。

1.3 主要儀器與設(shè)備

超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧電離源（ESI）（Waters XEVO TQ-XS，美國 Waters 公司）；JA3003 分析天平（萬分之一天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；高速勻漿機(jī)（T18 ULTRA-TURRAX，德國 IKA 公司）；高速離心機(jī)（Neofuge 18R，香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)）；超純水儀（UPL-1-100L，四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取10.0 mg 春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL 的棕色容量瓶中，超純水定容，得到1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，存放于-18 ℃冰箱中。臨用前，根據(jù)需要將其稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2 桃前處理 稱取5.00 g 均質(zhì)桃樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 1.0%甲酸的甲醇溶液高速勻漿1 min，于8 000 r/min 下離心5 min，后吸取上清液于50 mL 離心管。殘?jiān)屑尤?0 mL 1.0%甲酸的甲醇溶液，高速勻漿1 min，8 000 r/min 下離心5 min，吸取上清液，并且合并2 次上清液，加入5 g NaCl，振蕩1 min，吸取1.0 mL 上清液過0.22 μm 有機(jī)濾膜，濾液用于高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜檢測春雷霉素。

1.4.3 液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.3.1 液相色譜條件 色譜柱Waters ACQUITY UPLCBEH Amide Column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；樣品室的溫度15 ℃；流動相為乙腈溶液∶0.2%甲酸水溶液＝60∶40（V/V）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積 1.0 μL。

1.4.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離，正離子模式（ESI+）；毛細(xì)管電壓 3.0 kV；錐孔電壓 40 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度600 ℃；脫溶劑氣流量1 000 L/h；錐孔反吹氣 150 L/h。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下，以保留時間和離子對信息比較進(jìn)行定性分析，以母離子和響應(yīng)值最高的子離子進(jìn)行定量分析（表1）。

表1 春雷霉素質(zhì)譜條件

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確移取春雷霉素儲備液，并依次稀釋，配制成 10、20、40、100、200、400、1 000 μg/kg 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.4.3 的液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度對應(yīng)各組分色譜峰面積作圖，繪制線性關(guān)系曲線。

1.4.5 添加回收率測定 采用空白桃樣品，進(jìn)行加標(biāo)水平為 10、100、200 μg/kg 的回收率試驗(yàn)，每個加標(biāo)水平重復(fù)測定7 次，測定回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用向空白樣品中逐級降低加標(biāo)濃度，在較低濃度下且春雷霉素峰形較好時，以信噪比S/N＝3，計(jì)算方法的檢出限，信噪比S/N＝10 時，計(jì)算方法的定量下限（LOQ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的確定

考察了甲醇溶液、乙腈溶液、0.1%甲酸- 甲醇溶液、0.5%甲酸- 甲醇溶液、1.0%甲酸- 甲醇溶液、0.1%甲酸- 乙腈溶液、0.5%甲酸- 乙腈溶液、1.0%甲酸- 乙腈溶液對桃樣品中春雷霉素提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)1.0%甲酸- 甲醇溶液提取效果最好，回收率達(dá)到92.1%，故確定1.0%甲酸- 甲醇溶液為提取溶劑。

2.2 色譜條件的確定

春雷霉素極性大，在反相C18 色譜柱上沒保留，考慮采用對極性化合物保留作用較強(qiáng)的親水色譜柱，比較了Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Column 和Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC Column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）2 種色譜柱的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同色譜條件下，春雷霉素在Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Column 色譜柱上保留能力較好。進(jìn)一步考察了乙腈- 水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液作為流動相時對春雷霉素色譜峰的影響，綜合考慮峰形、保留時間、分離度和靈敏度，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%甲酸水溶液作為流動相時效果較好。當(dāng)流動相乙腈與0.2%甲酸體積比為60∶40 時，春雷霉素的色譜峰峰形對稱尖銳，且與雜質(zhì)分離較好，保留時間2.84 min（圖1）。故最終采用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Column 色譜柱，流動相為乙腈∶0.2%甲酸＝60∶40（V/V）進(jìn)行等度洗脫分離。

2.3 方法的線性關(guān)系分析

在10～1 000 μg/kg 范圍內(nèi)，春雷霉素的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Y＝5.11×105X－1.80×103，相關(guān)系數(shù)為 0.999。采用向空白樣品中逐級降低加標(biāo)濃度，在較低濃度下峰形較好時，以信噪比S/N＝3 計(jì)算得出方法的檢出限（LOD）為 3.0 μg/kg，信噪比 S/N＝10 計(jì)算出方法的定量下限（LOQ）為10.0 μg/kg。

2.4 春雷霉素在桃基質(zhì)中添加回收率和精密度分析

在空白桃中按照 10、100、200 μg/kg 添加春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度7 次平行，測定回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，在10～200 μg/kg 添加水平范圍內(nèi)，添加回收率為86.2%～91.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 2.2%～4.5%（表2），符合春雷霉素殘留分析要求。

表2 春雷霉素殘留回收率和和精密度（n＝7）

2.5 實(shí)際樣品測定分析

應(yīng)用所建立的方法對市售的100 份樣品進(jìn)行春雷霉素殘留的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 份樣品檢出含量值分別為 0.013、0.018、0.054、0.068、0.130 mg/kg，參照日本和歐盟規(guī)定的水果中春雷霉素的最大殘留限量值，其殘留均未超出最大殘留限量值。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)所建立的方法中，春雷霉素在10～1 000 μg/kg 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999；在添加水平為 10、100、200 μg/kg 時，平均添加回收率分別為86.2%、91.0%、89.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為 2.2%、3.7%、4.5%，方法檢出限為3.0 μg/kg，定量限為 10.0 μg/kg。本試驗(yàn)通過色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜測定桃中春雷霉素殘留的分析方法，該方法快速、簡便、準(zhǔn)確，可滿足桃中春雷霉素殘留檢測的要求，為春雷霉素的科學(xué)使用以及食品中春雷霉素的殘留分析和風(fēng)險評估提供重要依據(jù)。