張睿迪，關(guān)寶生,3，王嘉淇,3，尹相林,3，張淑紅，孫雪薇,3，羅晉成,3，盧 燁，高 升，白 雪

(1.佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.黑龍江省痛風(fēng)研究重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007)

近年來，高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA)已成為嚴重威脅人類健康的代謝性疾病之一，可誘發(fā)多種并發(fā)癥，如痛風(fēng)、心血管疾病以及腎臟疾病等[1]。有資料報道，西方發(fā)達國家人群HUA患病率呈逐年升高趨勢[2-4]，近幾年，我國的相關(guān)研究也顯示，部分地區(qū)人群HUA患病率大幅度提升，已經(jīng)與發(fā)達國家基本持平[5-7]。HUA現(xiàn)已成為我國排名第二的代謝性疾病[8]，其主要病因是機體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，進而引起體內(nèi)尿酸(uric acid,UA)水平升高，并以尿酸鹽晶體(monosodium urate crystal,MSU)的形式沉積在關(guān)節(jié)或臟器內(nèi)，誘發(fā)機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9]，進一步促進HUA轉(zhuǎn)變?yōu)橥达L(fēng)。因此，本研究通過構(gòu)建果蠅HUA模型，探討UA對果蠅爬行能力的影響，為進一步深入探討UA的致炎作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 果蠅品系及飼養(yǎng)條件本研究選用W1118野生型黑腹果蠅，由佳木斯大學(xué)尿酸生理功能研究團隊自有。果蠅均使用標準玉米粉培養(yǎng)基飼養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基。在溫度(25.0±0.5)℃、濕度(40.0±0.5)%、光照周期為12h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[10]。

1.2 實驗試劑腺嘌呤購于北京索萊寶生物科技有限公司，酵母購于英聯(lián)馬利(英國聯(lián)合食品集團)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及干預(yù) 收集羽化后8h內(nèi)果蠅1360只，雌雄各半；根據(jù)前期預(yù)實驗，本研究共設(shè)4個實驗組，分別為標準培養(yǎng)基的對照組、腺嘌呤濃度為0.1%的低濃度干預(yù)組、腺嘌呤濃度為0.2%的中濃度干預(yù)組和腺嘌呤濃度為0.3%的高濃度干預(yù)組；每組340只果蠅，其中雌性和雄性果蠅各170只，100只用于體內(nèi)UA水平的測定，240只用于爬行能力的測定。

1.3.2 果蠅體內(nèi)UA水平的測定 測定方法參照課題組前期已發(fā)表文章[11]，每組取果蠅25只并稱重，按重量(g)：蒸餾水(mL)=1：9的比例，用玻璃勻漿器制成組織勻漿，3000r/min離心10min，取上清液，利用ELISA法檢測UA水平[10]。

1.3.3 果蠅爬行能力的測定 將用于爬行能力測定的果蠅按照性別分為2組，每組120只，每組重復(fù)測試6次取平均值。根據(jù)課題組前期果蠅壽命實驗，高濃度干預(yù)組雄性果蠅的平均壽命為(6.16±2.11)d，雌性果蠅的平均壽命為(7.04±2.23)d，故本研究的實驗周期定為7d。爬行能力測試標準線設(shè)為8cm，時間為5s。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)分布檢驗結(jié)果為正態(tài)性的計量資料以“均數(shù)±標準差”描述，各實驗組數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗或卡方連續(xù)校正檢驗；檢驗水準α=0.05。果蠅爬行能力的測定結(jié)果采用Z評分法進行數(shù)據(jù)標準化后再進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組果蠅體內(nèi)UA水平隨著培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度的升高，各干預(yù)組果蠅體內(nèi)的UA水平逐漸升高，且與同性別對照組比較，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。另外，我們分析了相同干預(yù)條件下不同性別果蠅體內(nèi)UA水平的差異，與同干預(yù)組雌性果蠅比較，對照組、低濃度干預(yù)組和中濃度干預(yù)組雄性果蠅體內(nèi)的UA水平均顯著升高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高濃度干預(yù)組則相反，與同干預(yù)組雌性果蠅比較，雄性果蠅體內(nèi)的UA水平顯著降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 各組不同性別果蠅體內(nèi)UA水平

圖1 各組果蠅體內(nèi)UA水平

2.2 各組果蠅生存率比較對照組和低濃度干預(yù)組果蠅的生存狀態(tài)基本沒有變化，出現(xiàn)死亡往往是由于實驗操作失誤所造成；但隨著培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度的不斷升高，果蠅的生存率出現(xiàn)下降的趨勢，尤其是高濃度干預(yù)組果蠅，其生存率僅為59.17%，顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2、表3。另外，隨著培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度的不斷增加，雄性果蠅的死亡數(shù)量明顯高于雌性果蠅；尤其是高濃度干預(yù)組，雌性和雄性果蠅的生存率分別為80.83%和37.50%，兩者差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表2 各組果蠅生存率(n,%)

表3 各組果蠅生存率比較

表4 各組相同干預(yù)組雌雄性果蠅生存率比較(n=120)

2.3 UA對各實驗組果蠅爬行能力的影響隨著培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度的不斷升高，與對照組比較，各干預(yù)組果蠅的爬行能力均有不同程度的降低；中濃度干預(yù)組和高濃度干預(yù)組果蠅的爬行能力顯著降低，與同性別對照組比較差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。另外，我們分析了相同干預(yù)條件下不同性別果蠅爬行能力的差異，與雌性果蠅比較，對照組、低濃度干預(yù)組和中濃度干預(yù)組雄性果蠅的爬行能力變化不明顯，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但高濃度干預(yù)組雄性果蠅的爬行能力與雌性果蠅比較顯著降低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表5、表6。

表5 UA對果蠅爬行能力的影響

表6 UA對果蠅爬行能力影響結(jié)果的Z評分法標化數(shù)據(jù)表

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度的升高，果蠅體內(nèi)的UA水平逐漸升高，提示果蠅HUA模型構(gòu)建成功。我們的研究結(jié)果顯示：隨著果蠅體內(nèi)UA水平的逐漸升高，果蠅的生存率不斷降低，這一結(jié)果與我們課題組前期研究一致[11]。另外，果蠅的爬行能力隨著體內(nèi)UA水平的升高卻出現(xiàn)不同程度的下降，尤其中濃度干預(yù)組和高濃度干預(yù)組果蠅的爬行能力顯著低于同性別對照組，這種現(xiàn)象可能與體內(nèi)UA水平升高誘發(fā)炎癥反應(yīng)有關(guān)，進而影響果蠅的爬行能力。有研究顯示，尿酸鹽晶體在人體內(nèi)可激活Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein3,NLRP3)炎癥信號通路[12]，促進NLRP3炎癥小體的形成，通過調(diào)節(jié)Caspase-1蛋白酶的活性，剪切IL-1β前體蛋白，促使IL-1β成熟和釋放，誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及慢性腎損傷的發(fā)生[13-16]。故我們推測，在果蠅HUA模型中，UA通過誘發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生導(dǎo)致果蠅行動障礙。

另外，我們分析了相同干預(yù)條件下不同性別果蠅爬行能力的差異，發(fā)現(xiàn)高濃度干預(yù)組雄性果蠅的爬行能力與雌性果蠅比較顯著降低，提示雌激素在尿酸代謝及炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要的角色，這與課題組前期完成的一項研究結(jié)果一致[10]。這一結(jié)果為我們進一步探討雌激素對尿酸的調(diào)節(jié)作用及其機制提供了參考，為揭示HUA的病因提供了新思路，為臨床治療HUA提供了新的可能。

綜上所述，我們將進一步觀察果蠅HUA模型中炎癥相關(guān)因子的變化情況，探討UA的致炎作用及其機制，揭示其誘發(fā)果蠅爬行障礙的具體機制，同時，還將開展雌激素對UA體內(nèi)代謝的影響及其機制研究。