李興江，王鵬宇，宋妍婕，馮玉寬

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

當(dāng)前，肺癌仍是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，成為危及健康和生命的主要惡性疾病之一[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)為最常見(jiàn)的肺癌類型，約占肺癌人群的 85%，主要包括肺腺癌及鱗癌兩大病理類型[2]。多藥耐藥相關(guān)蛋白1(Multidrug Resistance-associated Protein 1: coded by ABCC1,MRP1/ABCC1)是一種ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它利用ATP水解的能量實(shí)現(xiàn)底物在細(xì)胞內(nèi)外的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，是腫瘤多藥耐藥(multi-drug resistanc-e，MDR)的主要靶標(biāo)。ABCC1在多種腫瘤中高表達(dá)，例如肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、腎癌和膀胱癌[3-7]。雖然ABCC1介導(dǎo)的腫瘤耐藥研究有較多報(bào)道，但是ABCC1在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性表型的影響，特別是ABCC1對(duì)非小細(xì)胞肺癌惡性轉(zhuǎn)化的能力的影響及其表達(dá)失調(diào)控的機(jī)制仍不確切。因此，評(píng)估ABCC1對(duì)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化能力影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)購(gòu)于中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。EGM培養(yǎng)基、胎牛血清從賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司購(gòu)買。pcDNA-copGFP慢病毒表達(dá)載體和Lipofectamine TM 2000 Reagent試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程公司。引物、抗體購(gòu)于銳博公司。CCK-8購(gòu)自于貝博公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于碧迪公司，Transwell小室于康寧公司購(gòu)買。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒轉(zhuǎn)染將從4℃冰箱中取出的EGM培養(yǎng)基與10% FBS混合制成完全培養(yǎng)基，并將恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)為37℃、CO2濃度調(diào)為5%，培養(yǎng)細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，按每孔3×105細(xì)胞接種于6孔板中。用針對(duì)人ABCC1 CDS區(qū)的PCR引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，并克隆至慢病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體pcDH-ABCC1。構(gòu)建的載體以DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定，表達(dá)ABCC1的慢病毒表達(dá)載體命名為L(zhǎng)v-ABCC1。應(yīng)用Lipofectamine 2000 將Lv-ABCC1慢病毒質(zhì)粒和空慢病毒(Lv-Control)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染239T包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后收集病毒感染ABCC1。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)收集的細(xì)胞用Trizol試劑提取總RNA，以總RNA為模板獲得DNA互補(bǔ)鏈，按試劑盒說(shuō)明使用PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒。cDNA樣品用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)樣品進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)，以均值進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)收集細(xì)胞，棄去上清液，PBS清洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液后，細(xì)胞收集并置于冰上。細(xì)胞裂解液勻漿收集。充分裂解，13000 r/min離心30 min。收集上清液，蛋白定量后與上樣緩沖液混合均勻，100℃水浴變性。SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2h；一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST液清洗3次；二抗室溫1h；TBST液洗3次。ECL顯色，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Laser-4000拍照、統(tǒng)計(jì)、分析結(jié)果。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)在96孔板中配置100μL的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24h(37℃，5% CO2)，向每孔加入10μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，重復(fù)檢測(cè)3次。

1.6 流式細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)單細(xì)胞懸液制備，分離的細(xì)胞，離心沉淀后用0.3mL含10%小牛血清的PBS懸浮，移入1.5mL EP管中，加入0.7mL無(wú)水乙醇，置-20℃下固定24h以上。3000 r/min離心30s，棄上清液，用 lmL PBS重懸細(xì)胞，再離心洗滌細(xì)胞1次。棄上清液，沉淀細(xì)胞用100μL 1mg/mL RNase A懸浮，37℃下放置30min。加入400μL 50μg/mL PI，置暗處10min。最后用流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)Matrigel基質(zhì)膠以1：8稀釋后包被Transwell小室底部膜的上室面(冰上操作)，3h風(fēng)干，水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50μL 10g/L BSA無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃，30min，常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，PBS洗1～2次，去除血清的影響，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105cells/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，24孔培養(yǎng)板下室內(nèi)加入600μL含10% FBS培養(yǎng)基。注意下層培養(yǎng)液與小室之間不要有氣泡；培養(yǎng)板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72h；取出小室，PBS清洗2次，用棉簽小心擦去小室微孔膜上層內(nèi)的細(xì)胞，在24孔板內(nèi)4%多聚甲醛固定20min，結(jié)晶紫溶液染色15min；倒置顯微鏡下拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取平均值，統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)Marker筆在6孔板背后，用直尺均勻劃?rùn)M線，大約每隔0.5～1cm劃一道，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)5條線，在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜能鋪滿即可，第二天用槍頭沿著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，放入37℃、CO2培養(yǎng)箱，按12h、24h、48h取樣，拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算各組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差(以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示)，統(tǒng)計(jì)處理采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。P值反映各組間的差別，P<0.05為有顯著性差異。采用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 ABCC1高表達(dá)細(xì)胞株的建立如圖1A所示，熒光顯微鏡下可觀察到重組病毒感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率在80%以上。重組病毒感染后72h，實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示Lv-ABCC1組ABCC1 mRNA表達(dá)水平較Lv-Control組和對(duì)照組明顯增加(P<0.01)，見(jiàn)圖1B；Western Blot 結(jié)果顯示ABCC1蛋白表達(dá)在三組之間的水平與ABCC1 mRNA表達(dá)水平一致(P<0.01),見(jiàn)圖1C。結(jié)果說(shuō)明我們通過(guò)慢病毒途徑成功建立了ABCC1過(guò)表達(dá)的BEAS-2B細(xì)胞。

圖1 ABCC1高表達(dá)的BEAS-2B細(xì)胞的建立

2.2 ABCC1對(duì)BEAS-2B細(xì)胞增殖的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，Lv-ABCC1組細(xì)胞增殖活性較Lv-Control組與對(duì)照組BEAS-2B細(xì)胞明顯增強(qiáng)(見(jiàn)圖2A，P=0.002)；流式細(xì)胞周期分析表明，Lv-ABCC1組細(xì)胞進(jìn)入S期的比例較Lv-Control組與對(duì)照組BEAS-2B細(xì)胞明顯增加(見(jiàn)圖2B，P=0.004)。以上結(jié)果說(shuō)明ABCC1促進(jìn)BEAS-2B細(xì)胞的增殖。

圖2 ABCC1促進(jìn) BEAS-2B細(xì)胞的增殖

2.3 ABCC1對(duì)BEAS-2B細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Lv-ABCC1組細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠及濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯增加，說(shuō)明Lv-ABCC1組細(xì)胞侵襲能力較Lv-Control組與對(duì)照組明顯增強(qiáng)(見(jiàn)圖3A，P=0.002)。細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Lv-ABCC1組細(xì)胞遷移能力較Lv-Control組與對(duì)照組BEAS-2B細(xì)胞明顯增強(qiáng)(見(jiàn)圖3B)。以上結(jié)果說(shuō)明，ABCC1促進(jìn)BEAS-2B細(xì)胞的侵襲和遷移。

圖3 ABCC1促進(jìn) BEAS-2B細(xì)胞的侵襲和遷移能力

3 討論

ABCC亞家族屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族7個(gè)亞家族之一，ABCC1是ABCC亞家族第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，亦是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員。它分布于體內(nèi)幾乎所有組織，可以轉(zhuǎn)運(yùn)多種不同底物，如藥物、重金屬離子、機(jī)體代謝毒物、谷胱甘肽、葡糖醛酸和硫結(jié)合物等。目前，多項(xiàng)研究表明ABCC1是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的最主要因素[8-12]，而且ABCC1在表達(dá)部位、調(diào)控機(jī)制和遺傳變異上所具有的特點(diǎn)，能夠使其成為理想的腫瘤生物標(biāo)記物、成為可以量身定制的化療靶點(diǎn)和可以成為操控腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物敏感性的治療靶點(diǎn)，因此關(guān)于ABCC1的研究具有極大的吸引力。

ABCC1高表達(dá)見(jiàn)于多種腫瘤組織，例如肺癌[13]、乳腺癌[14]、直腸癌[15]和胰腺癌[16]等，然而ABCC1在肺癌的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系卻有截然不同的結(jié)論,Li J等人[17]的研究顯示ABCC1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的無(wú)瘤生存率和總體生存率相關(guān)，而Merk[18]和Filipits[19]等人的研究則顯示ABCC1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的總體生存率不相關(guān)，對(duì)此，KunickT[8]認(rèn)為造成這種爭(zhēng)議可能與研究方法有關(guān)，如免疫組化抗體的選用，研究人群的種族或治療方案差異造成研究可信度不足和發(fā)生偏倚。

ABCC1的功能研究并不完整。ABCC1表達(dá)的調(diào)控研究和翻譯后加工機(jī)制知之甚少，特別是ABCC1啟動(dòng)子區(qū)域的表觀遺傳因素實(shí)際上還未見(jiàn)相關(guān)研究。目前，對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與經(jīng)典的促癌和抑癌信號(hào)通路間的互作研究關(guān)注不足，導(dǎo)致ABCC1功能研究不完整，特別是ABCC1是否也像家族其他成員如ABCG2等一樣，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移作用，鮮有相關(guān)報(bào)道，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)亦不完整。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒途徑(Lv-ABCC1)感染BEAS-2B細(xì)胞，結(jié)果顯示，ABCC1高表達(dá)可使人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B的增殖活性明顯增強(qiáng)，使細(xì)胞進(jìn)入S期的比例明顯增加，細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)。

由此可見(jiàn),ABCC1能夠顯著增加BEAS-2B細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)BEAS-2B細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。本研究對(duì)ABCC1具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移作用進(jìn)行了探討，將為該方向的研究提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)資料。