潘新宇，趙 玉，劉赫迪，于建渤

(1.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院病理診斷中心；2.黑龍江省腫瘤疾病防治重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011)

甲狀腺癌是世界范圍內日益普遍的惡性腫瘤[1]，近年來發(fā)病率一直穩(wěn)定上升，這幾乎完全歸因于對分化型甲狀腺癌，特別是PTC診斷的增加[2]。因此，PTC發(fā)生、發(fā)展的分子機制一直是研究熱點。目前研究[3]認為，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。已有研究指出，在PTC細胞中，泛素特異性蛋白酶33(ubiquitin-specific proteases 33,USP33)可以通過與Robo1的相互作用來增強Slit-Robo信號傳導并因此抑制腫瘤進展[4]。趨化因子受體4型(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)與不同的腫瘤均有密切聯(lián)系[5-6]，作為癌細胞歸巢和隨后轉移的不良預后標志和重要因素[7]，是癌癥轉移的關鍵調節(jié)因子[8]。Janus激酶介導從免疫反應到造血作用的基本生物學功能，是涉及影響造血和免疫細胞功能信號傳導途徑的酶。Janus激酶-3(Janus kinase 3,JAK3)在多種免疫系統(tǒng)疾病中扮演不同的角色[9-10]，其中JAK3在腫瘤中高表達，其表達水平與腎細胞癌[11]、淋巴瘤[12]、乳腺癌[13]等發(fā)生、發(fā)展密切相關，被認為是癌癥治療的潛在靶標。JAK3參與多種信號通路，且JAK3、STAT3為參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的經(jīng)典信號分子。

本實驗通過檢測USP33及CXCR4在PTC組織中的表達情況，研究兩者表達與患者臨床病理特征的關系。同時，檢測JAK3、STAT3mRNA在PTC組織及癌旁組織中的表達，初步探討JAK3、STAT3在PTC組織中的表達情況，推測USP33和CXCR4與JAK3、STAT3信號分子對PTC發(fā)生、發(fā)展的影響，為PTC預后情況的評估及分子靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 臨床資料以PTC患者為研究對象，收集2012年至2019年牡丹江醫(yī)學院病理診斷中心存檔的PTC組織及遠離癌組織3～5cm的正常組織50例。收集2018年至2019年外科手術標本，患者PTC組織及癌旁組織6對，液氮保存。患者臨床病理資料均完整，包括性別，年齡，腫瘤大小，遠處轉移，TNM分期等。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化 所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm厚切片，行免疫組化染色EnVision 法及HE染色，具體操作步驟以試劑盒ElivisionTM plus(兔)、MaxVisionTM HRP(羊)說明書為準，PBS代替一抗作為陰性對照。兔抗人USP33多克隆抗體購自美國proteintech公司；山羊抗人CXCR4多克隆抗體購自英國abcam公司。

1.2.2 qRT-PCR 使用mRNA提取試劑盒E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit(美國Omega Bio-Tek公司)從6個新鮮冰凍PTC組織和6個配對的癌旁組織中分離總RNA。根據(jù)制造商的說明使用逆轉錄系統(tǒng)試劑盒Transcriptor First Strand cDNA(美國賽默飛世爾科技公司)進行逆轉錄。利用Fast SYBR green PCR master mix(Roche)通過引物序列進行擴增。引物設計見表1。反應體系見表2。反應條件如下：總反應體系20μL，95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火1min，72℃延伸10min。進行40個循環(huán)。

表1 RT-qPCR引物序列

表2 RT-qPCR反應體系

1.2.3 Western blot檢測PTC組織及癌旁組織中USP33、CXCR4和 GAPDH 蛋白的表達 組織于液氮中研磨后加入裂解液充分裂解，4℃離心20min取上清液，沸水中變性8min，使用Nanodrop蛋白濃度測定儀器測量蛋白濃度，電泳完畢后將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉中室溫封閉1h，一抗孵育4℃過夜(USP33工作液稀釋比例1∶500;CXCR4工作液稀釋比例均為1∶1000;GAPDH為1∶5000)。二抗(工作液稀釋比例均為1∶10000)，室溫孵育1 h，SuperECL超敏發(fā)光液，避光作用1min，進行Amersham Imager 600系統(tǒng)顯色，目標蛋白及內參蛋白根據(jù)系統(tǒng)識別自動曝光。

1.3 結果判斷免疫組化：鏡下觀察，USP33定位于細胞質。USP33蛋白表達結果采用半定量積分法，按細胞著色強度評分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分。根據(jù)陽性細胞占所有腫瘤細胞的百分比評分：無細胞著色為0分，陽性細胞數(shù)≤25%為1分，26%～50% 為2分，51%～75%為3分，≥75% 為4分?？側旧u分=染色強度評分×陽性細胞百分比評分。總染色評分標準：0～3 分為陰性(-)，4～5分為弱陽性(+)，6～8 分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。將(-、+)歸入低表達組，(++、+++)歸入高表達組。CXCR4蛋白定位于細胞質,按照上述評分標準進行定級及統(tǒng)計分類。qRT-PCR：每個樣品重復3次，依據(jù)2-△△CT法計算各樣本mRNA的相對表達量。GAPDH為內參基因。Western blot：使用Image j對結果進行灰度分析，并記錄灰度數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)處理均由SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，圖像由Graphpad Prism 7.0繪制。計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，計數(shù)資料以n(%)表示。兩組間差異性比較采用配對樣本t檢驗。各組間樣本與臨床病理特征之間的關系采用卡方檢驗與Fisher概率確切計算法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 USP33和CXCR4蛋白的表達

2.1.1 HE染色結果 HE染色方法診斷PTC，并通過對HE染色與免疫組化染色后的切片進行對比，判斷USP33與CXCR4在PTC組織中呈現(xiàn)陽性部位的真實性與定位情況(見圖1)。

圖1 PTC病理組織學表現(xiàn)與USP33、CXCR4在PTC組織中的定位情況(×200)

2.1.2 免疫組化染色結果 免疫組化染色檢測USP33與CXCR4在PTC石蠟組織切片上的表達(見表3)，USP33呈現(xiàn)弱陽性表達的例數(shù)多于中-強陽性表達的例數(shù)，共21例，占總樣本量的42%，而CXCR4中等陽性與強陽性表達例數(shù)相近，各占38.7%與32.3%，且均高于弱陽性表達；此外，USP33與CXCR4在PTC組織及癌旁組織中表現(xiàn)出不同的表達模式(見圖2)：與癌旁組織相比，USP33在PTC組織中表達下調，CXCR4在PTC組織中表達上調。值得注意的是，USP33也可以高表達于PTC組織，CXCR4也可以低表達于PTC組織。為此，我們比較了USP33和CXCR4與臨床病理特征之間的相關性(見表4)，以便進一步分析上述現(xiàn)象。經(jīng)統(tǒng)計學分析得出，USP33蛋白表達與PTC腫瘤大小有關：PTC患者腫瘤組織體積較大時出現(xiàn)USP33表達下降(P<0.05)。除外，USP33表達與患者性別、年齡、遠處轉移等均無關(P>0.05)，見表4。CXCR4蛋白的表達與遠處轉移、TNM分期顯著相關(P<0.01)，見表4，與其他臨床病理特征無關。

表3 免疫組化染色方法檢測USP33和CXCR4在石蠟組織切片上的表達

圖2 甲狀腺正常組織和PTC組織的免疫組化染色結果(×200)

表4 USP33和CXCR4與臨床病理特征之間的相關性

2.2 USP33蛋白在PTC組織中的表達同免疫組化染色結果相同，USP33在癌旁組織中的表達高于PTC組織(P<0.05)，見圖3。

圖3 USP33在PTC組織中表達下調

2.3 USP33 mRNA在PTC組織中的表達通過對PTC組織及癌旁組織進行qRT-PCR檢測后表明，與癌旁組織相比，PTC組織中USP33表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4A。CXCR4mRNA和JAK3mRNA在PTC組織中的表達水平高于癌旁組織(P<0.05)，見圖4B、圖4C。STAT3 mRNA在PTC組織中的表達水平與在癌旁組織的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4D。

圖4 qRT-PCR技術檢測PTC組織及癌旁組織中各基因的表達

3 討論

甲狀腺癌是最近幾十年來所有實體瘤中增長最快的癌癥[14]。PTC是甲狀腺癌最主要的類型，約占所有甲狀腺癌的85%[15]。盡管治療模式已從一種一刀切的方法轉變?yōu)楦邆€性化的方案，從主動監(jiān)測到全甲狀腺切除術再行放射性碘殘留消融[16]，但大多數(shù)患者在診斷時便存在遠處轉移。在疾病早期發(fā)生局部和遠處擴散并非罕見的最初臨床征兆，疾病一旦擴散，具有治愈目的的治療選擇將受到限制。因此，能夠發(fā)現(xiàn)并鑒定出甲狀腺癌的新治療靶標顯得尤為重要。

USP33/VDU1是希佩爾·林道綜合征(VHL綜合征)蛋白相互作用去泛素化的第一個公認底物酶-1[17]，是一種調節(jié)自噬、中心體擴增、腫瘤生物學的去泛素化酶。最近有報道表明，通過檢測新鮮冰凍組織發(fā)現(xiàn)PTC組織中USP33 mRNA表達水平與癌旁組織相比下調。我們的研究結果雖無統(tǒng)計學意義，但有上述趨勢，這可能是由于樣本量過少或個體間差異所致，仍需要大樣本研究證實。在本研究中，通過收集50例PTC組織樣本，發(fā)現(xiàn) USP33在直徑較小腫瘤中高表達，在體積較大腫瘤中表達下調，提示USP33低水平與PTC不良預后相關，推測該去泛素化酶具有抗腫瘤潛力。為了進一步驗證蛋白水平上USP33的表達情況，我們進行了Western blot來驗證，同樣得到USP33在癌旁組織中的表達高于PTC組織中的表達，這一結果支持Jia等[4]的研究。19種趨化因子受體中，CXCR4是惡性腫瘤表達最廣泛的受體，并且其在腫瘤生物學中的作用也得到了最徹底的研究[18]。研究表明，CXCR4總是在轉移性病變中表達上調[19]，是腫瘤細胞遷移和侵襲的主要因素[20]。這與我們的研究一致，與癌旁組織相比，CXCR4在PTC組織中高表達。此外，CXCR4的蛋白表達水平與TNM分期的早期和遠處轉移顯著相關，推測CXCR4在腫瘤早期即發(fā)揮其作用，從而影響PTC的發(fā)展，但這仍需大樣本實驗支持這一結果。然而，USP33在PTC組織中低表達，CXCR4在PTC組織中高表達，這兩者在PTC中是否具有相互作用關系還尚未得知，仍需進一步生物學分析進行驗證。

Janus激酶作為一種非受體蛋白酪氨酸激酶，已被證明在調節(jié)各種細胞信號通路中起著重要的作用。JAK信號轉導子和轉錄激活子(STAT)通路對于腫瘤發(fā)生具有重要作用[21]。STAT蛋白被闡明為一組潛在的細胞質轉錄因子，它們在細胞因子信號傳導的反應中被激活[22]。JAK-STAT信號轉導異常會導致骨髓增生性腫瘤，白血病，淋巴瘤以及自身免疫性疾病[10]。Yang等[23]研究結果表明STAT3的磷酸化與FKBP14在結腸癌細胞中呈正相關，因此FKBP14可能通過促進結腸癌細胞中JAK/STAT信號通路的活性來促進增殖和遷移。Masoumi-Dehghi等[24]研究指出在卵巢癌中，JAK3-STAT3參與促進內皮細胞的遷移及其血管生成。其中JAK3在腫瘤中高表達，與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。和我們研究相同，JAK3mRNA在PTC組織中高表達。然而，STAT3在PTC組織中的表達與在癌旁組織中的表達無差異，這可能是由于患者間的個體差異及樣本量過少導致，需要進一步研究來證實。JAK3參與多種信號通路，它是否通過JAK/STAT這一途徑影響PTC的發(fā)生、發(fā)展及預后還未可知，我們推測其可能通過Jak3信號分子與USP33、CXCR4共同調節(jié)疾病，在腫瘤生物學的各個方面發(fā)揮重要的機制作用，但仍需進一步生物學分析加以證實。

綜上所述，通過檢測USP33和CXCR4在PTC組織中的表達情況及兩者與臨床病理特征的關系得出，與癌旁組織相比，USP33在PTC組織中表達下調，且USP33表達水平與腫瘤組織大小密切相關，提示USP33是PTC中一種潛在腫瘤抑制基因。與癌旁組織相比，CXCR4在PTC組織中表達上調，且CXCR4高表達與遠處轉移、TNM分期顯著相關，表明其與PTC的發(fā)展密切相關，有望成為評估預后的預測指標?？傊琔SP33與CXCR4均可影響PTC的發(fā)生、發(fā)展，而這兩者可能通過JAK3的相關信號通路進行調控。因此，USP33、CXCR4與JAK3信號分子有望為PTC的治療及防治提供新靶點。