白鑫宇,楊 萍,劉 萍

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis, CP)是一種臨床常見病，主要指前列腺組織受到異常刺激，引起以小腹和會陰部疼痛、尿道灼熱、排尿異常、尿后滴白等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群[1]，在中醫(yī)學(xué)屬“淋病”“癃閉”“尿濁”等疾病范疇，其發(fā)生多與患者外感濕熱、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞傷體虛等因素有關(guān)[2]，但機制研究尚不完善。西醫(yī)治療慢性前列腺炎雖有多種方法[3-4]，但整體療效欠佳，長期療效不確切。近年來中醫(yī)藥被廣泛應(yīng)用于慢性前列腺炎的輔助治療中，其在提高尿流量、控制炎癥反應(yīng)及改善患者臨床癥狀等方面具有獨特的療效[5-7]。

八正散出自中醫(yī)經(jīng)典著作《太平惠民和劑局方》，由萹蓄、車前子、瞿麥、滑石、甘草、梔子、木通及大黃八味藥組成。方中木通、車前子、瞿麥、萹蓄、滑石為利水通淋之品，清利濕熱[8-9]；伍以梔子，清泄三焦?jié)駸醄10]；大黃泄熱降火[11]；炙甘草調(diào)和諸藥，兼能清熱、緩急止痛。全方有清熱消炎、利水散結(jié)、瀉腹通便的作用，廣泛用于包括泌尿系統(tǒng)感染在內(nèi)的多種疾病[12]，已有研究顯示八正散可顯著改善慢性前列腺炎患者臨床癥狀和體征，藥理作用上發(fā)揮利尿、消炎、抑菌作用[13-14]，但是相關(guān)研究尚少、具體的作用機制還不明確。在臨床使用上，《中藥親試記》記載(張純錫著)，可用白茅根替代滑石，在現(xiàn)代中醫(yī)藥研究中，也有使用白茅根替代滑石進行辨證施治的先例[15-16]。因此，本文使用白茅根代替滑石進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

中藥復(fù)方治療臨床復(fù)雜疾病有獨到之處，但因成分多、機制復(fù)雜，使其進一步開發(fā)利用受到限制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)、分子生物學(xué)和藥理學(xué)，聯(lián)合在線數(shù)據(jù)庫、軟件等，挖掘藥物與疾病交集基因并進行分析展示，可視化后的數(shù)據(jù)能更直接地闡釋中藥復(fù)方與疾病的關(guān)聯(lián)性，全面探討方劑治療疾病的可能療效及機制。

1 資料與方法

1.1 八正散加減方靶點預(yù)測 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology, TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)篩選八正散加減方各藥味成份及靶點蛋白。將萹蓄、車前子、瞿麥、白茅根、甘草、梔子、木通及大黃分別輸入檢索框，獲取Ingredients，選取口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥ 30%，藥物相似度(drug like, DL)≥ 0.18且Caco-2 ≥ 0.4的化合物再找出相應(yīng)的靶點基因[17]。

1.2 慢性前列腺炎靶點預(yù)測 登錄GeneCards(https://www.gene-cards.org/)及OMIN(https://omim.org/)在線數(shù)據(jù)庫輸入“Chronic prostatitis”，獲取靶點基因[18-19]。

1.3 藥物靶點與疾病靶點標(biāo)準化及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，將以上獲得的八正散加減方靶標(biāo)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準基因名稱。分別將八正散加減方的靶點基因名和慢性前列腺炎靶點基因名導(dǎo)入Venn(http://bioinformaTics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線數(shù)據(jù)庫獲取兩者交集基因。在STRING(https://string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫中[20]，選擇“Multiple proteins”并輸入交集基因，設(shè)置最低相互作用得分為0.90，隱藏斷開連接的點，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)出tsv文件。通過barplot統(tǒng)計得出核心基因；將tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1(http://www.cy-toscape.org/)軟件，按照類別調(diào)整節(jié)點的顏色和字體大小后得到可視化結(jié)果。過程中所涉及的物種選項均設(shè)置為“Homo Sapiens(Human)”。

1.4 基因本體論(GO)和KEGG通路富集分析 使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在線數(shù)據(jù)庫[21]，設(shè)置P<0.05，進行GO和KEGG通路富集分析，然后使用R studio可視化，以反映八正散加減方治療慢性前列腺炎可能的生物過程、分子功能、細胞組分和通路。結(jié)果以條形圖或氣泡圖展示，P值越小，富集程度越高；count越大，則富集在上面的基因越多。

2 結(jié)果

2.1 八正散加減方活性成分及基因靶點名稱 從TCMSP在線數(shù)據(jù)庫檢索白茅根、萹蓄、車前子、大黃、甘草、瞿麥、木通、梔子，按照OB≥30%，DL≥0.18及Caco-2≥0.4的篩選條件，篩選出符合條件的活性化合物87個，基因靶點79個。其中白茅根包含3個化合物40個基因，扁蓄包含1個化合物3個基因，車前子包含3個化合物10個基因，大黃包含4個化合物34個基因，甘草包含71個化合物57個基因，木通包含5個化合物44個基因，梔子包含7個化合物51個基因，八正散加減方基因靶點信息見表1，八正散加減方中活性化合物基本信息(見表2)。

表1 八正散加減方基因靶點信息

表2 八正散加減方活性化合物基本信息

2.2 慢性前列腺炎靶點篩選 通過GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫獲取“Chronicprostatitis”靶點去重并查詢基因名，最終得到7397個基因名。

2.3 八正散加減方和慢性前列腺炎交集基因預(yù)測并構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 分別將八正散加減方(79個靶基因)和慢性前列腺炎(7397個靶基因)的靶基因名輸入Venn在線數(shù)據(jù)庫檢索框，得到兩者交集基因共69個，如圖1。將69個交集基因輸入STRING在線數(shù)據(jù)庫，按前述所說設(shè)置相應(yīng)值后得到PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2，圖中線條表示相互作用，不同顏色的線條表示不同的相互作用類型。Barplot所展示數(shù)據(jù)為該基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中所連接基因數(shù)，越多則該基因在網(wǎng)絡(luò)中的作用越關(guān)鍵，詳見圖3。經(jīng)Cytoscape所得可視化圖闡明了八正散加減方活性化合物和慢性前列腺炎疾病相關(guān)基因的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)(“成分-疾病-靶點”)(見圖4)。

圖1 八正散加減方和慢性前列腺炎Venn圖

圖4 八正散加減方和慢性前列腺炎“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.4 基因本體論(GO)富集分析結(jié)果 基因本體論(GO)富集分析結(jié)果認為，八正散加減方治療慢性前列腺炎可能是通過影響核受體、類固醇激素受體、蛋白質(zhì)異二聚體、單加氧酶、醇脫氫酶活性。通過結(jié)合、還原分子氧而作用于成對供體來調(diào)節(jié)氧化還原酶活性以及調(diào)控近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、谷胱甘肽結(jié)合、RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、雌激素受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、類固醇激素受體結(jié)合、RNA聚合酶II基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合過程也可能是八正散加減方發(fā)揮作用的方式(見圖5)。

圖5 八正散加減方治療慢性前列腺炎GO富集分析

2.5 KEGG富集分析結(jié)果 KEGG富集分析結(jié)果預(yù)測八正散加減方治療慢性前列腺炎可能通過多靶點完成，其中得分較為靠前的通路有：(1)AGE-RAGE信號通路；(2)IL-17信號通路；(3)Th17信號通路(見圖6～10)。

圖6 八正散加減方治療慢性前列腺炎KEGG富集

圖7 AGE-RAGE信號通路

圖8 IL-17信號通路

圖9 Th17信號通路

圖10 前列腺癌信號通路

3 討論

慢性前列腺炎致病機制復(fù)雜且并不完全清楚，加之前列腺解剖結(jié)構(gòu)特殊，給其治療帶來較大困難[22]。在中醫(yī)辨證施治的一項證型調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，其濕熱下注證型比例高達74%(總病例數(shù)位304)。這與自古中醫(yī)在治療前炎上也多以清泄?jié)駸?，利水通淋為主的實踐相吻合[23]。八正散為治療熱淋的常用方，具有清熱除濕、利水通淋的功能，用于濕熱淋證所致的尿頻、尿急、溺時澀痛、淋瀝不暢、尿色渾赤，甚則癃閉不通，小腹急滿，口燥咽干，舌苔黃膩，脈滑數(shù)。如前所述，滑石在臨床應(yīng)用中具有諸多禁忌，本文通過去滑石，加白茅根的加減方進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。方中木通苦寒，可瀉火行水，為本方君藥?！端幮哉摗分^其有“療五淋、利小便、除煩熱”之效，《本草拾遺》謂“利大小便，令人屯、寬下氣”，《食療本草》謂其“煮飲之，通婦人血氣，又除寒熱不通之氣，煮汁釀酒妙”，可知其有利尿通淋、瀉火、通利血脈之功。白茅根涼血止血，清熱利尿，同為本方君藥。瞿麥破血通經(jīng)、清熱利水，萹蓄殺蟲止癢、利尿通淋，車前子滲濕、利尿、通淋，為本方臣藥。萹蓄味苦、性微寒，有利水通淋、驅(qū)蟲療癢之功，如《本草匯言》載：“萹蓄，利濕熱，通利小便之藥也”《濱南本草》亦言其有“利尿通淋之功，可痊五淋之白濁、熱淋之澀痛，并可解瘀精之澀閉所致的水道之不通”。車前子味性甘微寒，《神農(nóng)本草經(jīng)》謂其有“止痛，利水道小便”之效，佐以梔子清利三焦?jié)駸?；大黃瀉熱通腸、逐瘀通經(jīng)，蕩滌邪熱使之從大便而去。使藥為甘草，可和藥緩急。以上研究表明，中醫(yī)藥治療本病時辨證施治，具有一定優(yōu)勢。八正散治療慢性前列腺炎在臨床已取得確切療效，但機制研究尚不明確。全面、詳細地闡明其作用機制有利于八正散的推廣使用、促進慢性前列腺炎的研究進展和優(yōu)化治療方案。

首先通過數(shù)據(jù)庫查詢八正散加減方各味藥可影響的基因數(shù)據(jù)，再通過疾病數(shù)據(jù)庫查找疾病的基因集合，對二個基因集合取交集，發(fā)現(xiàn)有69個交集基因，提示可以通過對交集基因的分析考察八正散加減方作用的靶點，通過GO基因分析，發(fā)現(xiàn)八正散加減方治療慢性前列腺炎可能是通過影響核受體、類固醇激素受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性協(xié)同完成八正散加減方活性成分在體內(nèi)的調(diào)控作用。MAPK受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、核內(nèi)固醇激素受體結(jié)合過程也可能是八正散加減方活性成分發(fā)揮治療作用的方式。以上預(yù)測結(jié)果為闡述八正散加減方治療前列腺炎提供了一定依據(jù)，還需要通過大量的臨床前及臨床實驗進行進一步確認。

通過KEGG進行分析，排除其他非相關(guān)性疾病，篩選出3個信號通路，分別為：(1)AGE-RAGE信號通路，預(yù)測認為八正散加減方可能是基于AGE/RAGE/JNK/NF-κB、Bcl-2/VEGF、SELE、VCAM、IL-6、CASP3等AGE-RAGE通路發(fā)揮治療慢性前列腺炎作用，詳見圖7；(2)IL-17信號通路；(3)Th17信號通路。這兩個通路均指向Th17分化途徑。目前已有研究證實炎癥途徑參與八正散治療前列腺炎的過程：嚴旭東等[8]通過臨床研究表明，聯(lián)用八正散加減方治療尿路感染能有效降低患者TNF-α、IL-6、IL-8及降鈣素原(PCT)，改善臨床癥狀、減少復(fù)發(fā)、提高生活質(zhì)量。本分析進一步提示抗炎免疫方向可能是研究八正散加減方作用機制新的突破口。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)前列腺癌信號通路在KEGG分析中富集顯著性P值小于0.001(P=1.62×10-7)，提示八正散加減方可能通過MAPK10/STAT3/RELA/CCND1/MAPK1/RB1/CASP9/BAX等基因，參與調(diào)控前列腺癌，這可能為進一步研究八正散加減方提供一定的指向性以及理論依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)證實八正散加減方治療慢性前列腺炎具有多靶點、多通路的特點，分析得出的可能作用方式和機制在現(xiàn)有研究中暫未涉及，或可為八正散和慢性前列腺炎的深入研究提供思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有其優(yōu)勢，也有受限之處，即整個過程的相關(guān)數(shù)據(jù)來源于已有研究，研究充分的內(nèi)容則為其所用，但被篩除的通路或靶點或許在疾病或藥物治療中發(fā)揮著重要作用，因此，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果進行目標(biāo)通路的功能驗證可以進一步為開發(fā)傳統(tǒng)方劑奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，八正散加減方治療慢性前列腺炎具有多靶點、多通路的特點。機制分析具有一定的指向性，可以為深入開發(fā)八正散提供理論依據(jù)。