呂佳佳，韋戀祝，付小英，林小青，高 杰

(遵義醫(yī)科大學(xué) 藥劑學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是繼阿霉素和順鉑后又一抗癌明星產(chǎn)品，其獨(dú)特的阻礙微管蛋白解聚的作用機(jī)制使其對(duì)多種實(shí)體瘤具有良好的療效[1-2]，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等[3-4]。臨床應(yīng)用的紫杉醇注射液需要以聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇為助溶劑，由此可能誘發(fā)患者產(chǎn)生致命的過敏反應(yīng)，以及紫杉醇對(duì)P-糖蛋白等外排蛋白的敏感性，長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，在一定程度上限制了紫杉醇的臨床應(yīng)用[5]。

在腫瘤的治療過程中，化療一直占據(jù)著重要地位。化學(xué)療法對(duì)腫瘤患者的病情的確有很大緩解，但這種緩解作用往往持續(xù)時(shí)間短暫，患者很快就會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥(Multi-drug resistance,MDR)現(xiàn)象[6-8]。姜黃素(Curcumin,Cur)是從姜黃中提取的一種天然有效成分，近年研究表明，姜黃素具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、改善心血管功能、保肝、增強(qiáng)免疫力等[9]。其中另有文獻(xiàn)報(bào)道，姜黃素可以減少細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白、米托蒽醌耐藥蛋白這3個(gè)重要的ABC藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體成員的表達(dá)量，有著逆轉(zhuǎn)多種腫瘤細(xì)胞耐藥性的作用[10-12]。但由于姜黃素存在疏水性強(qiáng)、穩(wěn)定性差以及體內(nèi)生物利用度低等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響其在臨床上的使用。

在眾多納米給藥體系中，脂質(zhì)體是近年來研究較多的藥物載體，具有良好的生物相容性和靶向性，并且可以改變被包封藥物的體內(nèi)分布，提高藥物治療指數(shù)和降低藥物毒性[13]。因此，脂質(zhì)體作為難溶性藥物的載體顯示了明顯的優(yōu)越性。本文擬將紫杉醇和姜黃素同時(shí)裝載于脂質(zhì)體中，構(gòu)成脂質(zhì)體雙載藥體系。利用高滲透和長(zhǎng)滯留效應(yīng)(Enhanced permeability and retention effect,EPR effect)將藥物有效地靶向腫瘤部位而發(fā)揮作用[14]。同時(shí)利用姜黃素抑制腫瘤的多藥耐藥性，進(jìn)一步改善紫杉醇的抗腫瘤效果。本文主要對(duì)紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體的處方及制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其包封率、粒徑、多分散系數(shù)、Zeta電位、穩(wěn)定性等制劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 紫杉醇對(duì)照品(批號(hào)：160504，純度：≥98%)、姜黃素對(duì)照品(批號(hào)：160421，純度：≥98%)均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；膽固醇(CHO，批號(hào)：P1276888)購(gòu)自上海Adamas試劑有限公司；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-OME，批號(hào)：B50845)、大豆卵磷脂(SPC，批號(hào)：SY-SI-170103)、氫化大豆磷脂(HSPC，批號(hào)：B50541)、蛋黃卵磷脂(EPC-98T，批號(hào)：AL17002)均購(gòu)自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；葡聚糖凝膠G-50(批號(hào)：S8151)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。測(cè)定用甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent1260型高效液相色譜系統(tǒng)(包括DAD檢測(cè)器、四元低壓梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、Chemstation工作站，美國(guó)Agilent公司)；NanoBrook 90 PLAS激光粒度及zeta電位分析儀(美國(guó)布魯克海文儀器公司)；UVD-680-1紫外檢測(cè)儀(上海金達(dá)生化儀器有限公司)；JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BT125D分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京有限公司)；ME204E分析天平(梅特勒·托利多儀器[上海]有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BF-2F恒溫?fù)u床(常州華冠儀器制造有限公司)；XH-T渦旋混合儀(金壇區(qū)白塔新寶儀器廠)；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DL-820D智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 分析方法的建立

1.3.1.1 溶液的配制 精密稱取紫杉醇對(duì)照品5.01 mg，置于50 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇充分溶解并定容，得質(zhì)量濃度為0.100 2 mg/mL的紫杉醇對(duì)照品溶液；精密稱取姜黃素對(duì)照品10.16 mg，置于25 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇充分溶解并定容，得質(zhì)量濃度為0.406 4 mg/mL的姜黃素對(duì)照品溶液；分別精密量取空白脂質(zhì)體和紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體400 μL(制備方法見1.3.2)，各加600 μL甲醇渦旋破乳，破乳后的溶液離心5 min(10 000 rpm)，吸取上清液過0.45 μm微孔濾膜即得空白樣品溶液和供試品溶液。

1.3.1.2 色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)～0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，45%～70% A；10～16 min，70%～45% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.1.3 專屬性考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白樣品溶液適量，按照“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。

1.3.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.3.1.1”項(xiàng)下紫杉醇對(duì)照品溶液0.5、1、1.5、2、3、5、7 mL分別于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻；同理精密吸取“1.3.1.1”項(xiàng)下姜黃素對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、4 mL分別于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按照“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.1.5 精密度試驗(yàn) 取低、中、高質(zhì)量濃度(10.2、20.4、50.1 μg/mL)的紫杉醇對(duì)照品溶液和低、中、高質(zhì)量濃度(4.406、20.32、81.28 μg/mL)的姜黃素對(duì)照品溶液，按照“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各組峰面積的RSD值。

1.3.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取400 μL紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體6份，按照“1.3.1.1”項(xiàng)下方法制得6份供試品溶液，并按“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各組峰面積的RSD值。

1.3.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取400 μL紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體按照“1.3.1.1”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，按“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄相應(yīng)的色譜峰面積。

1.3.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取空白脂質(zhì)體500 μL，分別加入質(zhì)量濃度為0.401 6 mg/mL紫杉醇對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.5、1.0、1.5 mL)和質(zhì)量濃度為0.406 4 mg/mL姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.5、1.0、1.5 mL)于10 mL離心管內(nèi)，加3 mL甲醇混勻渦旋5 min，破乳后離心5 min(轉(zhuǎn)速為10 000 rpm)，吸取上清液加甲醇定容至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，搖勻過0.45 μm微孔濾膜，按“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積計(jì)算其回收率。

1.3.2 雙載藥脂質(zhì)體的制備 稱取卵磷脂(3.32 mg)、膽固醇(0.86 mg)、DSPE-PEG2000-OME(1.35 mg)、姜黃素(0.13 mg)、紫杉醇(0.13 mg)溶于1.5 mL混合有機(jī)溶劑(氯仿∶甲醇v/v，2∶1)中，置梨形瓶?jī)?nèi)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜后，薄膜置于真空干燥器內(nèi)(放置6 h以上)，取出梨形瓶加入1 mL水化介質(zhì)水化30 min(25 ℃，180 rpm)，溶液移入EP管內(nèi)，探頭超聲(功率35%)2 min即得。

1.3.3 雙載藥脂質(zhì)體包封率的測(cè)定[15-16]采用葡聚糖凝膠(G50)色譜柱法分離紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體和游離藥物，使用HPLC法測(cè)定姜黃素和紫杉醇的含量。取200 μL紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體溶液加于G50柱頂端，以PBS緩沖液進(jìn)行脫液，連接紫外檢測(cè)儀，從紫外檢測(cè)信號(hào)開始時(shí)收集2 mL洗脫液于離心管內(nèi)。取過柱后的紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體溶液200 μL，加800 μL甲醇破乳，離心5 min(10 000 rpm)，取上清液按照“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定雙載藥脂質(zhì)體中藥物的含量，記為W包封；另取未過柱的紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體200 μL，加800 μL甲醇破乳同法處理后，取上清液按“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定總藥物的含量，記為W總。包封率(Encapsulation efficiency，EE)=W包封/W總×100%。注：W包封─包封于脂質(zhì)體中的姜黃素、紫杉醇的含量；W總─總姜黃素、紫杉醇的含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 磷脂種類考察 固定其他因素不變，只改變磷脂種類，分別使用大豆卵磷脂(SPC：3.24 mg)、氫化大豆磷脂(HSPC：3.25 mg)、蛋黃卵磷脂(EPC：3.24 mg)，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體，并按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行姜黃素和紫杉醇包封率的測(cè)定，考察磷脂種類對(duì)兩種藥物包封率的影響。

1.3.4.2 磷脂濃度考察 固定其它因素不變，只改變磷脂濃度，使SPC濃度分別為10、20、30、40、50、60 mg/mL，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體，并按“1.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定姜黃素和紫杉醇的包封率，考察磷脂濃度對(duì)兩種藥物包封率的影響。

1.3.4.3 磷脂-膽固醇比例考察 固定磷脂濃度40 mg/mL，使磷脂-膽固醇比例為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2，其余因素不變，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體，并按“1.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定姜黃素和紫杉醇的包封率，考察磷脂-膽固醇比例對(duì)兩種藥物包封率的影響。

1.3.4.4 藥脂比考察 固定磷脂濃度40 mg/mL，磷脂-膽固醇比例3∶1，使藥脂比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，其余因素不變，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體，并按“1.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定姜黃素和紫杉醇的包封率，考察藥脂比對(duì)兩種藥物包封率的影響。

1.3.4.5 水化介質(zhì)考察 固定磷脂濃度40 mg/mL，磷脂-膽固醇比例3∶1，藥脂比1∶30，水化介質(zhì)分別為超純水、生理鹽水、pH值分別為(7.0、7.4、6.5)的PBS緩沖液、Hepes緩沖液，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體，并按“1.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定姜黃素和紫杉醇的包封率，考察水化介質(zhì)對(duì)兩種藥物包封率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)

1.3.5.1 制備工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素考察結(jié)果，選取磷脂濃度、磷脂-膽固醇比(膜脂比)和藥脂比3個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素3個(gè)水平，以姜黃素和紫杉醇的包封率為考察指標(biāo)，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平表(見表1)。

表1 因素水平表

根據(jù)正交表L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體，并按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行姜黃素和紫杉醇包封率的測(cè)定。

1.3.5.2 驗(yàn)證性試驗(yàn) 按優(yōu)化后的條件平行制備3份紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體，并按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行姜黃素和紫杉醇包封率的測(cè)定。

1.3.6 雙載藥脂質(zhì)體藥劑學(xué)性質(zhì)的研究

1.3.6.1 雙載藥脂質(zhì)體粒徑和多分散系數(shù)考察 取紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體100 μL，加PBS緩沖液稀釋至2 mL，采用激光粒度儀對(duì)其粒徑及多分散系數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6.2 雙載藥脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察 將制備好的紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體放置于4 ℃冰箱中，分別于制備當(dāng)天(第1天)和制備后連續(xù)6 d取樣測(cè)定樣品的粒徑和Zeta電位，考察4 ℃條件下樣品穩(wěn)定性。

1.3.6.3 雙載藥脂質(zhì)體體外血清穩(wěn)定性考察 取紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體100 μL，加入等體積50%胎牛血清1∶1(v/v)混合，加入96孔板并在37 ℃、50 rpm搖床中孵育，分別于0、0.5、2、4、6、8、10、12、24和48 h對(duì)其濁度進(jìn)行測(cè)定(750 nm)，考察脂質(zhì)體在血清中的穩(wěn)定性。

1.3.6.4 雙載藥脂質(zhì)體形態(tài)考察 將紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體用超純水稀釋2倍，混合均勻，采用2%磷鎢酸負(fù)染法，小心滴加于覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，染色30 s～1 min，將銅網(wǎng)置于濾紙上自然干燥，然后將干燥后的銅網(wǎng)于透射電鏡下觀察形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 專屬性考察 測(cè)得色譜圖如圖1所示，在該測(cè)定條件下，對(duì)照品和供試品溶液色譜峰峰形良好，且空白樣品溶液在相應(yīng)位置沒有出現(xiàn)色譜峰，說明各類輔料對(duì)姜黃素與紫杉醇的含量測(cè)定均無干擾，表明方法專屬性良好。

A：PTX對(duì)照品溶液；B：Cur對(duì)照品溶液；C：PTX/Cur脂質(zhì)體樣品；D：空白脂質(zhì)體陰性對(duì)照。

2.1.2 線性關(guān)系考察 按照“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得紫杉醇回歸方程為Y=23.96X-15.07(R2=0.999 6)，表明紫杉醇在5.01～70.14 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；姜黃素回歸方程為Y=20.05X+7.09(R2=0.999 9)，表明姜黃素在4.41～162.56 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)各測(cè)定結(jié)果計(jì)算紫杉醇和姜黃素的RSD(n=6)值。結(jié)果見表2，表面儀器的日內(nèi)精密度與日間精密度均良好，同時(shí)雙載藥脂質(zhì)體供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，該方法重復(fù)性良好。

表2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(%，n=6)

2.1.4 加樣回收率試驗(yàn) 按“1.3.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積計(jì)算其回收率。結(jié)果紫杉醇的平均回收率分別為96.65%、96.26%、99.87%，RSD分別為0.45%、1.33%、0.85%；姜黃素的平均回收率分別為97.86%、99.80%、95.24%，RSD分別為0.44%、1.08%、0.75%，表明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 磷脂種類考察結(jié)果 由圖2可知，SPC制備的雙載藥脂質(zhì)體中姜黃素和紫杉醇的包封率比HSPC和EPC均高，故本實(shí)驗(yàn)選用大豆卵磷脂作為姜黃素和紫杉醇雙載藥脂質(zhì)體的成膜材料。

圖2 磷脂種類對(duì)姜黃素和紫杉醇包封率的影響(n=3)

2.2.2 磷脂濃度考察結(jié)果 由圖3可知，姜黃素和紫杉醇包封率隨著磷脂濃度的升高而增加，增加到40 mg/mL時(shí)趨于平穩(wěn)，當(dāng)磷脂濃度為60 mg/mL時(shí)姜黃素的包封率大于100%，可判斷該磷脂濃度下雙載藥脂質(zhì)體出現(xiàn)滲漏現(xiàn)象。在抽膜過程中，50～60 mg/mL的膜層出現(xiàn)固體顆粒析出，對(duì)其包封率有影響，不宜選用。故本實(shí)驗(yàn)選用40 mg/mL的磷脂濃度作為紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體的成膜濃度。

圖3 磷脂濃度對(duì)姜黃素和紫杉醇包封率的影響

2.2.3 磷脂-膽固醇比例考察結(jié)果 由圖4可知，磷脂-膽固醇比例為3∶1時(shí)姜黃素和紫杉醇的包封率最高，故本實(shí)驗(yàn)選用3∶1的磷脂-膽固醇比例作為紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體的膜脂比。

圖4 磷脂-膽固醇比例對(duì)姜黃素和紫杉醇包封率的影響

2.2.4 藥脂比考察結(jié)果 由圖5可知，隨著藥脂比的降低，姜黃素和紫杉醇的包封率先升高后降低，當(dāng)藥脂比為1∶30時(shí)，包封率達(dá)到最高。實(shí)驗(yàn)過程中藥脂比為1∶10所制備的雙載藥脂質(zhì)體在探頭超聲后出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，說明藥脂比過大會(huì)超出脂質(zhì)雙分子層的包載能力，不能形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體，所以包封率小。故本實(shí)驗(yàn)選用1∶30的藥脂比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖5 藥脂比對(duì)姜黃素和紫杉醇包封率的影響

2.2.5 水化介質(zhì)考察結(jié)果 由圖6可知，復(fù)方脂質(zhì)體中采用pH 6.5的PBS緩沖液作為水化介質(zhì)時(shí)姜黃素和紫杉醇包封率最好，因?yàn)樗橘|(zhì)的濃度、pH值、離子種類等會(huì)對(duì)磷脂頭部的電離層產(chǎn)生影響，故選用PBS緩沖液(pH 6.5)作為復(fù)方脂質(zhì)體的水化介質(zhì)。

圖6 水化介質(zhì)對(duì)姜黃素和紫杉醇包封率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，A因素K2最大，B因素K3最大，C因素K1最大，所以最佳制備工藝為A2B3C1。極差R為C>B>A，其中說明C因素的影響最大，即藥脂比，其次是膜脂比，磷脂濃度的影響較小。并且由表4可知B、C項(xiàng)中P<0.05，存在顯著性差異，A項(xiàng)中P>0.05，無顯著性差異。最終確定處方和制備工藝為：磷脂濃度為40 mg/mL，膜脂比為4∶1，藥脂比為1∶40，以pH 6.5的PBS緩沖液為水化介質(zhì)，水化溫度為25 ℃，水化時(shí)間30 min。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果 由表5可知，3份紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體的總包封率較高，且結(jié)果波動(dòng)不大。故確定最佳制備工藝為：磷脂濃度為40 mg/mL，膜脂比為4∶1，藥脂比為1∶40，以pH 6.5的PBS緩沖液為水化介質(zhì)，水化溫度為25 ℃，水化時(shí)間30 min。

表5 處方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.5 雙載藥脂質(zhì)體藥劑學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果

2.5.1 雙載藥脂質(zhì)體粒徑和多分散系數(shù)考察結(jié)果 由表6和圖7可知，紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體粒徑為(107.39±1.85)nm，多分散系數(shù)為(0.238±0.002)，結(jié)果表明，雙載藥脂質(zhì)體在PBS緩沖液中分布均勻，粒徑適宜，均在100 nm左右，分散較好。

表6 紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體粒徑電位考察結(jié)果

圖7 紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體粒徑分布

2.5.2 雙載藥脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察結(jié)果 如圖8、9所示，紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體溶液在4 ℃避光條件下粒度分布均勻，無絮集現(xiàn)象產(chǎn)生，連續(xù)7 d測(cè)定其粒徑和Zeta電位，變化不大，其中第7天測(cè)定的粒徑為103.97 nm，表明紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體較為穩(wěn)定。

圖8 雙載藥脂質(zhì)體粒徑穩(wěn)定性結(jié)果

圖9 雙載藥脂質(zhì)體Zeta電位穩(wěn)定性結(jié)果

2.5.3 雙載藥脂質(zhì)體體外血清穩(wěn)定性考察結(jié)果 由圖10可知，紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體在48 h內(nèi)濁度沒有明顯變化，說明脂質(zhì)體在血清環(huán)境中均較為穩(wěn)定，不會(huì)發(fā)生明顯的聚集或者蛋白吸附現(xiàn)象。這主要是由于PEG親水層可以屏蔽脂質(zhì)體的表面電荷，減少與血漿蛋白的相互作用，增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

圖10 紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體在血清中的穩(wěn)定性

2.5.4 雙載藥脂質(zhì)體形態(tài)考察 由圖11可知，制得的脂質(zhì)體形態(tài)均勻，大多呈球形或類球形，粒徑在100 nm左右。

圖11 紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體透射電鏡圖

3 討論

脂質(zhì)體的制備方法常有薄膜分散-超聲法、逆向蒸發(fā)法、注入法(乙醇注入法、乙醚注入法)等[17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)資料以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考慮采用薄膜分散-超聲法制備紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體，并采用G50葡聚糖凝膠過柱法測(cè)定其包封率。同時(shí)前期對(duì)成膜溫度也進(jìn)行考察，根據(jù)成膜后膜的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)判，溫度較低時(shí)茄型瓶底部出現(xiàn)凝集，溫度過高則膜周圍出現(xiàn)空洞現(xiàn)象，同時(shí)為兼顧兩者的包封率以及粒徑等因素最終選擇在25℃條件制備脂質(zhì)體。在磷脂種類考察時(shí)發(fā)現(xiàn)HSPC和EPC包封率相對(duì)較低，可能是因?yàn)樗鼈兙鶠楦唢柡投嚷蚜字?，制備脂質(zhì)體時(shí)會(huì)使其磷脂雙分子層的流動(dòng)性降低，從而減少脂質(zhì)體包載藥物的能力。另考察磷脂-膽固醇比例發(fā)現(xiàn)隨著膽固醇比例不斷增高，藥物的包封率隨之下降，主要是由于膽固醇可使脂質(zhì)雙分子層剛性增加，降低脂質(zhì)膜流動(dòng)性，從而降低脂溶性藥物的包載。

傳統(tǒng)普通脂質(zhì)體在血液循環(huán)中易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，因此本實(shí)驗(yàn)加入PEG化磷脂(DSPE-PEG2000-OME)進(jìn)行修飾以延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。由于PEG 親水層可以屏蔽脂質(zhì)體的表面電荷，減少與血漿成分的聚集或蛋白吸附現(xiàn)象，在雙載藥脂質(zhì)體體外血清穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)。經(jīng)過試驗(yàn)優(yōu)化制備的復(fù)方脂質(zhì)體為大小均一，形態(tài)規(guī)整的類球形脂質(zhì)體，粒徑為(107.39±1.68)nm，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，粒徑在100～200 nm的納米粒子對(duì)實(shí)體瘤具有更高通透性和更強(qiáng)的EPR效應(yīng)[14]。紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體既可以被動(dòng)靶向到腫瘤組織，提高其在腫瘤部位的藥物濃度，又可以在腫瘤部位緩慢發(fā)揮紫杉醇的抗腫瘤作用和姜黃素抑制腫瘤多藥耐藥的作用，從而達(dá)到雙載藥的目的。本文主要研究了紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體的處方工藝和相關(guān)藥劑學(xué)性質(zhì)，為后續(xù)體內(nèi)評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。