王 石 王欽欽，2 胡 深 肖志明 劉曉露 田 靜 樊 霞*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京100081；2.青島市華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，山東青島266101；3.湖北省飼料監(jiān)測(cè)所，湖北武漢430070）

飼料用香味劑是一類利用畜禽嗅覺、味覺等生理 學(xué)原理，用來改善和增強(qiáng)飼料天然口味與氣味，促進(jìn)采食、生長(zhǎng)的飼料添加劑[1]?！讹暳咸砑觿┢贩N目錄（2013）》（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2045號(hào)）中規(guī)定了在養(yǎng)殖動(dòng)物中允許使用的飼料用香味劑種類（其中包含了GB 2760中允許使用的食品用香料）。香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛作為目前應(yīng)用較為廣泛的重要食用香料，已被逐步推廣并應(yīng)用于飼料及飼料添加劑生產(chǎn)中。香芹酚（Carvacrol，分子式為C10H14O，分子量152.2）和百里香酚（Thymol，分子式C10H14O，分子量152.2）是一對(duì)同分異構(gòu)體，具有特殊的百里香和麝香草香氣，天然存在于百里香、牛至精油中，具有宜人香氣和很強(qiáng)的殺菌作用[2-4]。丁香酚（Eugenol，分子式C10H12O2，分子量164.2）具有濃郁的石竹麝香氣味，能增加飼料香味，引誘動(dòng)物進(jìn)食[5]。肉桂醛（Cinnamal?dehyde，分子式為C9H8O，分子量132.2）是一種醛類有機(jī)化合物，黃色黏稠狀液體，大量存在于肉桂等植物體內(nèi)，具有強(qiáng)烈的桂皮和肉桂特有香氣。肉桂醛具有很好的抗霉殺菌作用，添加了肉桂醛的飼料，能保存很長(zhǎng)時(shí)間不發(fā)霉、不變色變味[6-8]。由于具有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)、改進(jìn)飼料效率以及控制禽畜細(xì)菌性下痢、防止飼料霉變等功能，香芹酚、肉桂醛等多種香味物質(zhì)在飼料中的推廣及應(yīng)用日益增加，已成為了一類重要的飼料添加劑。關(guān)于飼料香味劑的檢測(cè)技術(shù)已有諸多報(bào)道[9-14]，但現(xiàn)有報(bào)道中多限于1～2種香味劑的測(cè)定，多種香味物質(zhì)同步聯(lián)檢的方法報(bào)道不多。建立飼料及飼料添加劑中多種香味成分的聯(lián)檢方法，對(duì)香味成分進(jìn)行定量檢測(cè)，有助于規(guī)范飼料香味劑產(chǎn)品市場(chǎng)，并為合理使用飼料香味劑產(chǎn)品提供技術(shù)支撐。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，通過對(duì)樣品前處理方法與色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了氣相色譜同時(shí)測(cè)定飼料及飼料添加劑中香芹酚、百里香酚、丁香酚、肉桂醛等4種香味物質(zhì)含量的定量分析方法。該方法具有檢測(cè)時(shí)間短、前處理操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)，滿足大部分飼料產(chǎn)品的檢測(cè)需求，能對(duì)市場(chǎng)上存在的該類產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供實(shí)樣品

市售飼料、飼料添加劑及添加劑預(yù)混合飼料樣品均由國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京）在全國(guó)范圍采集獲得。

1.1.2 儀器和設(shè)備

6890N型氣相色譜儀，配有FID檢測(cè)器（美國(guó)Agi?lent公司）；SK5200LHC型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲器有限公司）；Himac CF 16RX型高速離心機(jī)（日本Hitachi公司）；MS3 digital 型渦漩混勻器（德國(guó)IKA公司）；Million-Q型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.1.3 試劑和溶液

乙醇、乙腈、乙醚、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（30～60 ℃）（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；肉桂醛、百里香酚、香芹酚和丁香酚對(duì)照品（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，純度≥99.0%）；1.0 mg/ml 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（95%乙醇配制，在2～8 ℃之間避光儲(chǔ)存，有效期1 個(gè)月）；1.0、5.0、10.0、50.0、100、500 μg/ml 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（95%乙醇配制，現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.5 g 樣品（精確至0.000 1 g），將其置于50 ml聚丙烯離心管中。加入約2.5 ml水將樣品浸濕，再加入20 ml無水乙醇，振蕩混勻后于超聲波清洗機(jī)中超聲提取20 min。10 000 r/min 離心5 min，收集上清液置于50 ml 容量瓶中。殘?jiān)?0 ml 無水乙醇重復(fù)提取一次，合并2 次提取液，無水乙醇定容后充分混勻，用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。當(dāng)溶液中香芹酚、肉桂醛等物質(zhì)的含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之外時(shí)，需用吸量管移取一定體積的上述樣品溶液，用95%乙醇稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍。

1.2.2 色譜分離條件

毛細(xì)管色譜柱：Agilent HP-Innowax，30 m×0.32 mm×0.25 μm；升溫程序：初始溫度80 ℃，以12 ℃/min 的速率升溫至140 ℃，以6 ℃/min 升溫至170 ℃，保持3 min，以25 ℃/min升溫至240 ℃；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；檢測(cè)器：FID檢測(cè)器；檢測(cè)器溫度：260 ℃；進(jìn)樣量：1.0 ml；分流比：10∶1；載氣：氮?dú)狻?/p>

2013年11月召開的十八屆三中全會(huì)提出了我國(guó)要進(jìn)行全面深化改革。近年來，國(guó)務(wù)院也提出了“放管服”的改革思路。在這一政治背景下，我國(guó)招標(biāo)代理也面臨著行業(yè)改革。

1.2.3 定性定量檢測(cè)

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，試樣中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間相差在±0.2 min 之內(nèi)，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。在儀器最佳工作條件下，取試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分峰面積為縱坐標(biāo)，被測(cè)組分濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。外標(biāo)法計(jì)算樣品中香芹酚等組分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 氣相色譜柱選擇

氣相色譜技術(shù)主要是利用物質(zhì)的沸點(diǎn)、極性及對(duì)固定相吸附性質(zhì)的差異來實(shí)現(xiàn)混合物的分離。由于樣品中各組分的沸點(diǎn)、極性或吸附性能不同，每種組分都在流動(dòng)相和固定相之間進(jìn)行反復(fù)多次的分配或吸附/解吸，在載氣中濃度大的組分先流出色譜柱，而在固定相中分配濃度大的組分后流出，從而達(dá)到了分離的目的[15]。氣相分離主要受目標(biāo)物的汽化難易程度和分子對(duì)固定相的吸附影響。香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛等皆為小分子弱極性化合物，沸點(diǎn)在232～255 ℃之間。又因4種化合物都具有含氧基團(tuán)，因此適合使用中等極性或極性色譜柱對(duì)其進(jìn)行分離。在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，選擇了3種不同的極性色譜柱對(duì)4種香味物質(zhì)進(jìn)行分離測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中的載氣流量及升溫程序等條件參考了董茂鋒等[16]、李會(huì)榮等[17]撰寫的相關(guān)文獻(xiàn)，在較優(yōu)色譜條件的基礎(chǔ)上得到的結(jié)果見表1。

通過實(shí)驗(yàn)考查表1中不同型號(hào)的毛細(xì)管色譜柱，并對(duì)相鄰兩色譜峰間的分離度、保留時(shí)間與色譜峰形等參數(shù)進(jìn)行比較，研究發(fā)現(xiàn)使用HP-Innowax 毛細(xì)管色譜柱的分離效果最佳（香芹酚與百里香酚的分離度R=2.9），分析時(shí)間較長(zhǎng)。FFAP 色譜柱分析時(shí)間與HP-Innowax 相似，但分離度明顯降低。而毛細(xì)管色譜柱DB-5 的分析時(shí)間最短，其只能使香芹酚和百里香酚基本分離，目標(biāo)峰拖尾，峰形較差。綜合分離度、保留時(shí)間、峰形等因素，實(shí)驗(yàn)選擇了HP-Innowax毛細(xì)管色譜柱作為固定相，進(jìn)一步研究升溫程序?qū)Ψ蛛x效果的影響。

表1 香芹酚和百里香酚在不同色譜柱上的分離度

2.1.2 升溫程序確定

氣相升溫程序是影響色譜峰分離度和保留時(shí)間的另一個(gè)重要參數(shù)，實(shí)驗(yàn)對(duì)不同升溫程序進(jìn)行考察。固定色譜柱型號(hào)、載氣流速等條件，改變升溫程序，所得分離結(jié)果見表2。表2中的R為香芹酚和百里酚的分離度，T 為毛細(xì)管色譜柱中出峰順序最晚組分（香芹酚）的保留時(shí)間。

表2 升溫程序?qū)ιV分離的影響

2.2 樣品前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取方式優(yōu)化

稱取2.5 g 空白配合飼料樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加（添加濃度為100 mg/kg），以該飼料為待測(cè)樣品，乙醇為提取溶劑，考察了超聲提取和索氏提取兩種提取方式對(duì)飼料樣品中香芹酚等物質(zhì)提取效率的影響。將超聲提取時(shí)間設(shè)定為20 min，重復(fù)提取2 次，索氏提取時(shí)間設(shè)定為40 min。2 種方式提取得到的溶液在50 ml 容量瓶中定容后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果見圖1。

由圖1 可以看出，在提取時(shí)間相同的情況下(40 min)，兩種提取方式得到的丁香酚、百里香酚、香芹酚等三種香味物質(zhì)的收率都可達(dá)90%左右；而肉桂醛在高溫下不穩(wěn)定，容易發(fā)生氧化反應(yīng)，索氏提取的回收率僅為58%，相較之下，超聲提取的效率更高，回收率可達(dá)76%。因此，最終選取超聲提取作為樣品前處理方法。

圖1 不同提取方式對(duì)回收率的影響

2.2.2 提取溶劑的選擇

適合的提取溶劑有利于提高樣品中香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛的提取效率，實(shí)驗(yàn)考察不同提取溶劑對(duì)香味劑提取效率的影響。稱取2.5 g空白配合飼料樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加（添加濃度為100 mg/kg），以該飼料為待測(cè)樣品。選擇了7種常規(guī)有機(jī)溶劑，通過超聲提取，比較石油醚、正己烷、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、乙醇和乙腈對(duì)待測(cè)樣品中各香味劑的提取效率，所得結(jié)果見圖2。

由圖2 可以看出，對(duì)于香芹酚、百里香酚和丁香酚3組分，7種溶劑中乙酸乙酯的提取效率最佳，當(dāng)乙酸乙酯為溶劑時(shí)，香芹酚等3組分的回收率明顯高于其他6 種試劑；而石油醚的提取效率最低，其對(duì)百里香酚、香芹酚提取的回收率已低于80%；乙醇等5 種溶劑的提取效率介于乙酸乙酯和石油醚之間，且這5種溶劑的提取效率沒有顯著差別。而對(duì)于肉桂醛，乙腈和石油醚的提取效率較低，回收率僅為60%左右，乙醇、乙酸乙酯等5種溶劑的差異不顯著。

圖2 不同提取溶劑對(duì)回收率的影響（配合飼料基質(zhì)添加）

而對(duì)于水溶性包被的飼料香味劑樣品（為防止香味物質(zhì)揮發(fā)，飼料中常用淀粉、果膠包被香味組分），7 種溶劑的提取效率均較低，測(cè)量值僅為標(biāo)示量的50%～60%，這嚴(yán)重影響了樣品的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用少量的去離子水作為破壁劑對(duì)樣品進(jìn)行潤(rùn)濕，然后使用乙醇作為提取溶劑，該方式對(duì)以果膠包被的水溶性樣品具有很好的效果，其回收率皆高于75%。因此提取溶劑選擇：加入少量的水潤(rùn)濕樣品，再加入乙醇超聲提取。

2.2.3 提取溫度影響

有文獻(xiàn)報(bào)道，香芹酚、百里香酚等酚類化合物具有較好的熱穩(wěn)定性，80 ℃以上加熱處理，飼料、制劑、產(chǎn)品中有效成分損失僅為0.79%[18]。而肉桂醛卻因含有醛基基團(tuán)，在飼料中存在微量金屬元素的條件下易發(fā)生催化氧化，因此在高溫處理時(shí)易造成損失。針對(duì)該特性，實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溫度進(jìn)行優(yōu)化，考察溫度對(duì)各香味物質(zhì)的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，通過對(duì)比25 ℃、45 ℃和65 ℃條件下的提取效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取溫度對(duì)香芹酚、百里香酚和丁香酚的影響并不顯著，但高溫卻使得肉桂醛的收率急劇降低。65 ℃條件下，香芹酚、百里香酚等3 種香味物質(zhì)的收率未有顯著變化（回收率皆大于90%）。而肉桂醛在65 ℃條件下，其回收率減低到50%～60%。因此，同時(shí)考慮4種香味物質(zhì)的回收率和基質(zhì)干擾，最終選擇的提取溫度為室溫。

圖3 不同提取溫度對(duì)回收率的影響

2.2.4 提取時(shí)間影響

稱取2.5 g 空白配合飼料樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加（添加濃度為100 mg/kg），以該飼料為待測(cè)樣品，考察超聲提取時(shí)間對(duì)香味劑回收率的影響，結(jié)果見圖4。在提取時(shí)間方面，香芹酚、百里香酚和丁香酚等香味物質(zhì)的含量隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)略有而增加，當(dāng)超聲提取5 min 時(shí)，回收率約為85%；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)到20 min，回收率進(jìn)一步增加，達(dá)到94%左右；繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，回收率變化并不顯著。而隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中肉桂醛逐漸損失，當(dāng)20 min時(shí)，其回收率已低于80%（見圖4）。因此，綜合考量4 種香味成分的提取效率，最終我們選擇的提取時(shí)間為20 min，重復(fù)提取2 次。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)回收率的影響

2.3 線性關(guān)系

配制濃度為1.0～500 μg/ml 的香芹酚、百里香酚、丁香酚、肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，以1.2.2色譜分離條件進(jìn)行檢測(cè)，以色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

從表3中可以看出：香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0～500 μg/ml 的范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性關(guān)系良好。

表3 香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛對(duì)照溶液線性實(shí)驗(yàn)

2.4 方法檢測(cè)限

實(shí)驗(yàn)對(duì)方法的檢測(cè)極限進(jìn)行探討，隨機(jī)抽取不同來源的20份飼料樣品，按照1.2所述方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定，代表性的空白及添加樣品色譜圖如圖5所示。在目標(biāo)化合物的保留時(shí)間內(nèi)沒有干擾峰的出現(xiàn)，表明該方法的選擇性良好。根據(jù)20個(gè)空白樣品的基線噪音，取其平均值，以信噪比（S/N）=3 為檢出限（Limits of Detection，LOD），S/N=10 為定量限（Limits of Quantification，LOQ），肉桂醛、香芹酚、百里香酚、丁香酚等4 種化合物的LOD、LOQ 分別為10 mg/kg 和20 mg/kg。

圖5 4種香味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（a, 150 μg/ml）、添加飼料樣品（b, 100 mg/kg）及空白樣品（c）色譜圖

2.5 方法準(zhǔn)確度與精密度

選擇具有代表性的飼料樣品，包括雞配合料、奶牛精料補(bǔ)充料、仔豬預(yù)混料進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。按照1.2 所述方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定，方法的準(zhǔn)確度、精密度見表4。

由表4 可以看出，不同基質(zhì)中4 種香味劑的回收率為：75.9%～108.5%，符合在一定濃度水平上的回收率范圍；方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤8.1%。

表4 不同飼料中添加香芹酚、百里香酚、丁香酚、肉桂醛的回收率及精密度（n=6，%）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

通過建立方法對(duì)市場(chǎng)上收購(gòu)的3 種飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表5。

由表5可以看出，樣品中香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛的測(cè)定值與標(biāo)示值基本一致(以標(biāo)示量為約定值，則測(cè)定值與約定值的相對(duì)誤差值均不大于8.3%)，該方法可以滿足對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表5 飼料樣品的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了氣相色譜同步測(cè)定飼料中肉桂醛、丁香酚、百里香酚和香芹酚含量的分析方法。通過建立方法進(jìn)行分析，4種香味劑在15 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)氣相色譜基線分離。方法的檢出限為10 mg/kg，定量限為20 mg/kg，平 均 回 收 率 為75.9%～108.5%，RSD≤8.1%。該方法具有檢測(cè)時(shí)間短、前處理操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可以滿足對(duì)飼料中香芹酚、丁香酚、百里香酚和肉桂醛含量的同步檢測(cè)。