熊 鑫，楊啟琨，劉 凱，瞿勇強(qiáng)，雷普平，王尚文，李玉華

（昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease，CHD），簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病。冠心病是目前心血管系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)，且猝死率最高的疾病。在我國(guó)，冠心病患病人數(shù)約1 100萬(wàn)，其死亡率約為232.2/10 萬(wàn)人[1]。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，冠心病猝死的發(fā)生與G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程有一定的相關(guān)性[2-4]。GPCR 是一類(lèi)定位于細(xì)胞膜表面的受體蛋白，主要參與了心臟的副交感神經(jīng)激活、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展等多種生理過(guò)程[5-7]。RGS 作為一類(lèi)GTP 酶激活蛋白（GAP），可以將GTP 的水解速度提高2000 倍，從而可以直接調(diào)節(jié)G 蛋白信號(hào)通路的持續(xù)時(shí)間[8]。目前已證實(shí)了RGS 蛋白在心肌肥大、心率過(guò)緩、心臟衰竭等過(guò)程中具有重要作用[9-13]。RGS17 作為RZ/A 家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)RGS17 在小鼠心臟中有表達(dá)[14]，但RGS17 在人體心臟中的表達(dá)及功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)收集冠心病猝死案例41 例及非心源性猝死案例10 例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)來(lái)研究RGS17 在冠脈組織中的表達(dá)情況，以期為后續(xù)其功能研究奠定基礎(chǔ)，并且還能為心源性猝死客觀、準(zhǔn)確的鑒定提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 樣本來(lái)源樣本來(lái)源：收集來(lái)自某鑒定中心提供死亡原因分別為冠心病猝死者及交通事故或高墜致顱腦損傷死亡者的冠脈組織，性別不限，室溫密封條件下，組織置于4%甲醛溶液中保存。

實(shí)驗(yàn)組：41 例冠心病猝死案例作為實(shí)驗(yàn)組，并根據(jù)冠狀動(dòng)脈管腔狹窄程度分為：實(shí)驗(yàn)組1（Ⅰ-Ⅱ級(jí)）7 例，實(shí)驗(yàn)組2（Ⅲ級(jí)）12 例，實(shí)驗(yàn)組3（Ⅳ級(jí)）22 例。

對(duì)照組：交通事故或高墜致顱腦損傷死亡案例10 例作為對(duì)照組。

1.1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組選取案例共同標(biāo)準(zhǔn)：（1）死亡時(shí)間距尸檢間隔時(shí)間48 h 以內(nèi)，解剖及病理切片未見(jiàn)心肌組織腐敗，降低死后改變的影響；（2）常見(jiàn)毒藥物檢測(cè)陰性。

實(shí)驗(yàn)組選取案例標(biāo)準(zhǔn)：（1）法醫(yī)病理學(xué)檢驗(yàn)為冠心病導(dǎo)致死亡；（2）排除其他導(dǎo)致心肌損傷的因素（如醫(yī)療搶救措施、中毒等）；（3）排除其他心血管系統(tǒng)疾?。ü谛牟〕猓?；（4）實(shí)驗(yàn)組1（Ⅰ～Ⅱ級(jí)）為經(jīng)過(guò)法醫(yī)病理學(xué)檢驗(yàn)排除其他導(dǎo)致死亡的疾病、損傷等，來(lái)確定為冠心病猝死。

對(duì)照組選取案例標(biāo)準(zhǔn)：（1）法醫(yī)病理學(xué)檢驗(yàn)為交通事故或高墜致顱腦損傷死亡；（2）無(wú)心血管系統(tǒng)疾病。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑主要實(shí)驗(yàn)儀器：生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、生物組織自動(dòng)染色機(jī)、光學(xué)顯微鏡Leica DM4000B 及顯微照相系統(tǒng)（德國(guó)徠卡）。

主要試劑：通用二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、動(dòng)物免疫血清（羊）、RGS17 多克隆抗體（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 取材部位及免疫組化、HE 染色實(shí)驗(yàn)組選取冠脈取最狹窄處，對(duì)照組冠狀動(dòng)脈取材位置選取前降支主干，取材大小為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm。組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、攤片后進(jìn)行免疫組化及HE 染色。免疫組化采用通用二步法進(jìn)行染色。

1.2.2 圖像分析及統(tǒng)計(jì)每張免疫組化切片取四個(gè)高倍視野（400 倍），分別采用Image-Pro Plus 6.0 系統(tǒng)軟件進(jìn)行平均光密度測(cè)定分析并取其平均值，結(jié)果使用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（One-way-ANOVA），先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊選用LSD 法; 方差不齊選用Dunnett’s T3法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組案例基本情況

41 例案例中，男性32 例，女性9 例，年齡25～69 歲，以41～50 歲多見(jiàn)，見(jiàn)表1。冠狀動(dòng)脈狹窄程度Ⅰ級(jí)1 例，Ⅱ級(jí)6 例，Ⅲ級(jí)12 例，Ⅳ22 例。

2.2 HE 染色結(jié)果

經(jīng)法醫(yī)病理檢驗(yàn)，41 例猝死案例均被證實(shí)為冠心病導(dǎo)致死亡，見(jiàn)圖1。

2.3 IHC 染色結(jié)果

免疫組化表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2，陽(yáng)性表達(dá)部位為圖中棕黃色或棕褐色者，呈長(zhǎng)梭形、層狀，排列整齊，為血管中膜平滑肌組織，內(nèi)膜及外膜未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。

2.4 IPP 6.0 光密度分析結(jié)果

表1 實(shí)驗(yàn)組案例基本情況Tab.1 The basic situation of the experimental group

圖1 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組心臟冠狀動(dòng)脈管壁HE 染色（×40）Fig.1 HE staining of coronary artery wall in the experimental group and control group （×40）

圖2 RGS17 在冠心病猝死者心臟冠狀動(dòng)脈管壁組織中的表達(dá)情況（×400）Fig.2 Expressions of coronary artery wall tissue with sudden coronary death （×400）

結(jié)果顯示，除了實(shí)驗(yàn)組2 和實(shí)驗(yàn)組3 的平均光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2、圖3。

表2 冠狀動(dòng)脈管壁組織陽(yáng)性表達(dá)物光密度值范圍（）Tab.2 Optical density value ranges of positive expressions in coronary artery wall tissue （）

表2 冠狀動(dòng)脈管壁組織陽(yáng)性表達(dá)物光密度值范圍（）Tab.2 Optical density value ranges of positive expressions in coronary artery wall tissue （）

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組1 比較，#P<0.05。

圖3 冠狀動(dòng)脈管壁組織陽(yáng)性表達(dá)物平均光密度值統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 Statistical map of mean optical density of positive expressions in coronary artery wall tissue。*P<0.05。

3 討論

經(jīng)研究，所收集的41 例冠心病案例中，以男性多見(jiàn)，男女比例約為3.5:1，年齡在25～69 歲之間，主要集中在30～50 歲。采用SPSS23.0 對(duì)所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，顯著性=0.466＞0.05，使用LSD 檢驗(yàn)，組間兩兩比較。各實(shí)驗(yàn)組中RGS17 表達(dá)明顯高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3 中RGS17 的表達(dá)均明顯高于實(shí)驗(yàn)組1。實(shí)驗(yàn)組3 中RGS17 的表達(dá)與實(shí)驗(yàn)組2中無(wú)明顯差異。

本文通過(guò)免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，RGS17 在冠心病猝死者冠脈中表達(dá)明顯上升。本次分組所收集案例中以冠脈Ⅳ級(jí)狹窄多見(jiàn)，由于冠脈狹窄程度越高，越容易導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，從而致其死亡，因此以Ⅳ級(jí)狹窄多見(jiàn)，而冠脈Ⅰ、Ⅱ級(jí)狹窄猝死者較少見(jiàn)，導(dǎo)致本次實(shí)驗(yàn)組分組不均。本次研究中，實(shí)驗(yàn)組3 與實(shí)驗(yàn)組2 中無(wú)明顯差異，考慮原因可能為實(shí)驗(yàn)組2 的材料過(guò)少，導(dǎo)致其差異不明顯；或由于冠脈Ⅲ級(jí)狹窄與冠脈Ⅳ級(jí)狹窄導(dǎo)致其供血程度相差不大，即冠狀動(dòng)脈狹窄程度分級(jí)不能精細(xì)地反映冠狀動(dòng)脈狹窄的實(shí)際嚴(yán)重程度，致使檢測(cè)結(jié)果差異不明顯。

RGS17 表達(dá)位于血管中膜平滑肌組織，而內(nèi)膜及外膜未見(jiàn)表達(dá)。血管中膜主要由收縮型血管平滑肌細(xì)胞及少量的巨唾細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成，其中血管平滑肌細(xì)胞是決定粥樣硬化斑塊“纖維帽”穩(wěn)定性的主要因素[15]。大量研究證實(shí)，“纖維帽”的破裂是引起“易損斑塊”破潰，從而導(dǎo)致心腦血管事件的發(fā)生[16]。當(dāng)血管內(nèi)皮受到損傷時(shí)，炎性因子刺激血管平滑肌細(xì)胞由“伸縮型”向“合成型”發(fā)生轉(zhuǎn)換，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞穿過(guò)彈性膜進(jìn)入損傷血管內(nèi)膜，包繞炎性細(xì)胞、脂質(zhì)條紋等，從而促進(jìn)了粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。有研究表明血管平滑肌細(xì)胞凋亡與粥樣硬化斑塊的破潰、血管重塑形成有關(guān)，同時(shí)也促進(jìn)了血管壁的鈣化[17]。通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)，RGS17 作為一類(lèi)負(fù)性調(diào)蛋白，在冠心病猝死者冠脈中膜呈明顯高表達(dá)，且中膜血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡對(duì)于斑塊的破潰有著重大影響，因此可以考慮RGS17 通過(guò)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的影響，來(lái)導(dǎo)致冠心病猝死的發(fā)生發(fā)展。

該結(jié)果表明，RGS17 在冠心病猝死的法醫(yī)學(xué)鑒定中有可能成為一個(gè)新的輔助參考指標(biāo)，RGS17在冠心病冠脈中膜組織中呈明顯高表達(dá)，提示了RGS17 可能參與并影響冠心病的發(fā)生發(fā)展，但其在冠心病發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制和生物學(xué)功能尚不清楚，仍需進(jìn)一步的研究。