唐詩聰，陳 東，郭 瑢，楊德春，趙英竹，謝 呂，張 潛，劉德權(quán)，王曉莉，唐一吟

（1）云南省腫瘤醫(yī)院，昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院乳腺外一科；2）超聲醫(yī)學(xué)科；3）乳腺外二科，云南昆明 650118；4）廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽胰腺乳腺甲狀腺外科，廣西南寧 530021；5）云南省紅河州婦幼保健院乳腺保健科，云南蒙自 661100；6）云南省腫瘤醫(yī)院，昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院放射治療科，云南昆明 650118）

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，發(fā)病機制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。HER-2 陽性乳腺癌是乳腺癌中的一種，該亞型乳腺癌增殖能力強，預(yù)后差[2]。約有25%～30%乳腺癌患者的癌組織表達(dá)HER-2[2]?？笻ER-2 治療能給患者帶來較好的預(yù)后，但HER-2 陽性乳腺癌的生物學(xué)行為仍有未解之謎。

實體瘤與腫瘤血管新生關(guān)系密切，腫瘤會因為缺乏養(yǎng)分、生長因子以及氧氣的供給而限制生長[3]。研究表明實體腫瘤在距離功能血管≥70 μm處便會出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象，在不能誘導(dǎo)血管新生的腫瘤中，腫瘤大小不會超過1～2 mm[4]。惡性腫瘤自身強大的誘導(dǎo)血管生成能力是其不斷增殖并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個重要因素[5]。因此研究腫瘤的血管生成是腫瘤研究領(lǐng)域的一個熱點問題。

MicroRNA （miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[6]。miRNA 參與體內(nèi)70%以上基因的調(diào)控，包括癌基因、編碼血管新生相關(guān)蛋白的基因、編碼降解細(xì)胞外基質(zhì)分子的基因等[7]。miR-21 是miRNA 的一種，近年有研究報道[8]miR-21 在癌和癌旁組織中存在差役表達(dá)，并且其過表達(dá)可能和腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)。也有研究[9]提示miR-21 可能有促進(jìn)血管新生的作用。但miR-21 在HER-2 陽性乳腺癌中的作用則仍有未解之謎。本課題擬通過研究miR-21 在HER-2 陽性乳腺癌的表達(dá)，并探討其對HER-2 陽性乳腺癌細(xì)胞血管新生的影響，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系，為乳腺癌血管新生中的作用和機制提供新理論和實驗依據(jù)。筆者通過研究，為防治乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移尋找新的分子標(biāo)志物和潛在的重要靶點奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本40 例腫瘤組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本取自云南省腫瘤醫(yī)院乳腺外一科標(biāo)本庫。所有患者術(shù)前均未接受化療并簽署知情同意書。所有標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)云南省腫瘤醫(yī)院病理科診斷為HER-2 過表達(dá)型乳腺癌（ER 陰性、PR 陰性、HER-2 陽性）。標(biāo)本獲得年限均為2019 年。本次研究通過云南省腫瘤醫(yī)院倫理審查委員會同意。

1.1.2 試劑及材料實驗所用MCF-10A 和SKB-R3 細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。HBSS 緩沖液和胎牛血清（購自Invitrogen），TaKaRa Universal RNA Extraction Kit（云南澤浩商貿(mào)有限公司）、PrimeScript RT reagent Kit （云南澤浩商貿(mào)有限公司）、SYBRPremix Ex TaqTMII（云南澤浩商貿(mào)有限公司）、引物合成（廣西科迪試劑公司）、miR-21 inhibitor 與陰性對照（廣州銳博公司）、抗-VEGF （1:2000 稀釋；Abcam，ab32152），二-抗羊抗兔IgG H&L （HRP）（1:1000 稀釋；Abcam，ab205718）、Lipofectamine2000（Invitrogen）、蛋白裂解液（南京諾唯贊生物科技有限公司）、CCK8試劑（云南澤浩商貿(mào)有限公司）、Matrigel 膠（購自Corning）。免疫組化試劑由云南省腫瘤醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)在內(nèi)含MCF-10A 或SKB-R3 細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入含有RPMI-1640 的完全培養(yǎng)液（內(nèi)含10 mL 的10%胎牛血清）之后放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃飽和濕度。每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，2～3 d 進(jìn)行傳代。

1.2.2 miR-21 inhibitor 轉(zhuǎn)染miR-21 抑制劑序列5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3'，陰性對照序列（Negative contro）l 5'-CAGUACUUUUGUG UAGUACAA-3'。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后根據(jù)說明，采用Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染100 nM 的抑制劑或陰性對照序列至SKB-R3 細(xì)胞。之后確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 RNA 提取以及熒光定量 PCR（qRT-PCR）將未行轉(zhuǎn)染的SKB-R3 細(xì)胞、分別轉(zhuǎn)染miR-21 抑制劑和陰性對照序列（Negative control）的細(xì)胞以及MCF-10A 培養(yǎng)24 h。使用TaKaRa Universal RNA Extraction Kit 提取RNA。再將組織剪碎之后同樣方法提取組織RNA。再加入PrimeScript RT reagent Kit 試劑，在PCR 儀中37℃15 min 之后85℃5 s 處理完成逆轉(zhuǎn)錄。再加入SYBRPremix Ex TaqTMII 試劑以及引物完成熒光定量PCR。miR-21 上游引物：5'-ACGTTGTGTAGCT TATCAGACTG-3。下游引物：5'-AATGGTTGTTCT CCACACTCTC-3'。內(nèi)參U6上游引物 ：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'下游引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）取培養(yǎng)瓶中對數(shù)期生長的細(xì)胞，去除培養(yǎng)液。PBS 洗滌后，再加入RIPA 與PMSF 混合的裂解液，混勻之后置于充分裂解20 min。把裂解下的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中。取干凈玻璃板對齊夾緊于架子上，在玻璃板中制備分離膠和濃縮膠之后上樣。置于電泳槽，濃縮膠80 V，分離膠120 V，開始電泳。備0.22 μm PVDF 膜，浸泡在甲醇中5 min，在PVDF膜上覆蓋濾紙，置于夾子中夾好。再放入轉(zhuǎn)膜槽，150 mA 轉(zhuǎn)移2.5 h 開始轉(zhuǎn)膜。時間到后取出PVDF膜，見PVDF 膜上已有Marker。PBS 漂洗后封閉。放入一抗稀釋液中，4 ℃下置于搖床，孵育過夜。后取出PVDF 膜，室溫放置，PBS 浸泡。將膜放入二抗稀釋液中，置于搖床，室溫條件下孵育2 h。之后Bio-rad 掃膜顯影。

1.2.5 CCK8 實驗取對數(shù)期生長的細(xì)胞，常規(guī)消化，重懸細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105個/mL。取250 μL 上述細(xì)胞懸液稀釋，調(diào)整總體積至5 000 μL，調(diào)整濃度為2 000 個細(xì)胞/100 μL，在96 孔板的每個孔滴加100 μL 細(xì)胞懸液，共設(shè)4 個時間節(jié)點（0 h，24 h，48 h，72 h），加CCK-8 試劑10 μL，孔板放在5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在酶標(biāo)儀內(nèi)檢測在450 nm 吸光度。

1.2.6 Transwell 侵襲遷移實驗把Matrigel 膠放置于4℃冰箱過夜，溶解Matrigel 膠。稀釋Matrigel膠至終濃度為3 mg/mL。在每孔Transwell 小室的上層小室加入已稀釋過的Matrigel 膠60 μL，平穩(wěn)搖動，使其完全覆蓋，把已鋪基底膜的Transwell 小室24 孔板放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min。去除基底膜并水化。取饑餓處理厚的對數(shù)細(xì)胞常，制備細(xì)胞懸液，控制細(xì)胞終濃度為5×105個/mL。在24孔板Traswell 小室下層小室加入完全培養(yǎng)液700 μL，清除上下層小室接觸面氣泡，培養(yǎng)24 h，條件為5%CO2、37 ℃。取出上層小室，去除培養(yǎng)液，PBS 洗滌，甲醇固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗滌。把Transwell 小室倒置，計數(shù)并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理?；颊呋€特征的比較通過χ2檢驗完成。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，2 組間比較采用單因素t檢驗完成。使用Kmplot 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/）進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21 在HER-2 陽性乳腺癌的表達(dá)

所有病例均是HER-2 過表達(dá)型乳腺癌（ER陰性、PR 陰性、HER-2 陽性）。超聲診斷可見其邊緣不整，血供豐富（見圖1A）；病理學(xué)免疫組化診斷可見HER-2 強陽性（見圖1B）；對于HER-2++患者，F(xiàn)ISH 診斷提示HER-2 基因擴增（見圖1C）。QPCR 實驗結(jié)果提示miR-21 在乳腺癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織中低表達(dá)（P＜0.001，見圖2A）；Kmplot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析結(jié)果提示miR-21 在乳腺癌中過表達(dá)與低表達(dá)的預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.47，見圖2B），在HER-2 陽性型乳腺癌中該現(xiàn)象仍然存在（P=0.26，見圖2C）。之后，將miR-21 表達(dá)量分為高表達(dá)與低表達(dá)，并分析了其在HER-2 過表達(dá)乳腺癌患者中與臨床基線特征的關(guān)系，見表1。

2.2 miR-21 對HER-2 陽性乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

miR-21 在乳腺癌正常細(xì)胞MCF-10A 中低表達(dá)，而在HER-2 過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞SKB-R3 中高表達(dá)（P＜0.01，見圖3A）。之后分別轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑和陰性對照組序列至SKB-R3 細(xì)胞（見圖3B）。之后GFP 熒光確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率（見圖3C）。通過CCK8 實驗，發(fā)現(xiàn)抑制miR-21 表達(dá)之后細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.05，見圖3D），Transwell 實驗也證實抑制miR-21 表達(dá)之后細(xì)胞侵襲能力下降（P＜0.001，見圖3E）。

2.3 miR-21 對HER-2 陽性乳腺癌血管生成的影響

為了探討miR-21 對HER-2 陽性乳腺癌血管生成的影響，筆者選擇促血管生成的VEGF 作為研究對象，通過Western blotting 實驗發(fā)現(xiàn)SKB-R3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 抑制劑后VEGF 表達(dá)下降，而轉(zhuǎn)染陰性對照組序列的細(xì)胞VEGF 表達(dá)量未下降，見圖4。miR-21 抑制劑使得VEGF 表達(dá)下降，陰性對照組序列不能下調(diào)VEGF 表達(dá)。

圖1 HER-2 陽性乳腺癌的診斷（×100）Fig.1 The diagnosis of breast cancer with HER-2 positive （×100）

圖2 miR-21 在組織的表達(dá)與預(yù)后Fig.2 The expression of miR-21 in tissues and its prognosis

表1 miR-21 表達(dá)情況與40 例乳腺癌患者基線特征［n=40，n（%）］Tab.1 The correlation of expression of miR-21 and baseline with 40 breast cancer patients ［n=40，n（%）］

圖3 miR-21 對HER-2 陽性乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響Fig.3 miR-21 influenced the proliferation and invasion of HER-2 positive breast cancer

圖4 miR-21 對HER-2 陽性乳腺癌血管生成的影響Fig.4 miR-21 influenced the angiogenesis of HER-2 positive breast cancer

3 討論

MiRNA-21 在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移方面起著十分重要作用，甚至成為某些腫瘤的標(biāo)志分子[10-11]。miR-21 在多種癌中都存在差異表達(dá)：Deng 等[12]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞株中miRNA-21 的含量低于正常細(xì)胞。Alanazi I O[13]等則發(fā)現(xiàn)miRNA-21在肺癌中過表達(dá)。Zhang C[14]等學(xué)者研究認(rèn)為miRNA-21 在乳腺癌組織中高表達(dá)，而在癌旁組織中低表達(dá)。筆者通過實驗發(fā)現(xiàn)miR-21 是一個癌基因，在HER-2 陽性型乳腺癌中過表達(dá)，在癌旁組織中低表達(dá)。該研究結(jié)論與Zhang C 等[14]相仿。因此筆者認(rèn)為miR-21 在HER-2 陽性乳腺癌的表達(dá)由一定診斷價值。在進(jìn)一步的生存分析中筆者發(fā)現(xiàn)，無論是在乳腺癌所有患者或者在HER-2 過表達(dá)患者中，OS 在miR-21 高低表達(dá)組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此認(rèn)為miR-21 的過表達(dá)對預(yù)后并不能產(chǎn)生影響。

MiR-21 雖然不能對腫瘤預(yù)后產(chǎn)生影響，但是現(xiàn)在有不少研究認(rèn)為miR-21 可對腫瘤生物學(xué)行為產(chǎn)生一定的影響。Wang T[15]等發(fā)現(xiàn)miR-21 可通過激活PI3K/AKT 通路促進(jìn)結(jié)腸癌增殖并抑制凋亡。Zhang C[14]等則發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中，miR-21 可通過抑制STAT3 的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。筆者本次實驗發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)miR-21 的HER-2 陽性乳腺癌細(xì)胞株中抑制miR-21 表達(dá)后，細(xì)胞的增殖和侵襲能力均減弱。由此，筆者認(rèn)為miR-21 過表達(dá)可促進(jìn)HER-2 陽性乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移，對其生物學(xué)行為的調(diào)控能發(fā)揮一定的作用。

惡性腫瘤自身誘導(dǎo)血管生成是其生長的重要部分[16]。血管內(nèi)皮生長因子是目前已知的促進(jìn)血管新生功能最為明確的一類細(xì)胞因子，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC 等多種亞型[17]。惡性腫瘤中過表達(dá)這些因子能夠通過與細(xì)胞膜上的受體VEGFR 結(jié)合來激活下游P13K、EKR、AKT 等信號通路，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移[18]。目前關(guān)于miR-21 在HER-2 陽性乳腺癌中對血管生成的影響還未見文獻(xiàn)報道。筆者通過體外實驗發(fā)現(xiàn)抑制miR-21 表達(dá)，能夠下調(diào)SKB-R3 細(xì)胞中VEGF 的表達(dá)。因此認(rèn)為miR-21有潛在的調(diào)控HER-2 陽性乳腺癌血管生成的能力。在該科學(xué)問題的報道上，該研究具有較大的創(chuàng)新性和原創(chuàng)性。因為本次研究缺乏體內(nèi)實驗的研究，故數(shù)據(jù)有待在下一步研究中更加完善。

筆者通過本次研究發(fā)現(xiàn)了miR-21 是一種腫瘤基因，在HER-2 陽性乳腺癌中過表達(dá)，但其過表達(dá)不會影響預(yù)后。miR-21 可促進(jìn)HER-2 陽性乳腺癌的增殖和侵襲，并且抑制miR-21 的表達(dá)可抑制血管生成因子VEGF 的表達(dá)，因此認(rèn)為miR-21 對HER-2 陽性乳腺癌的血管生成有一定的調(diào)控作用。希望本次研究的結(jié)論能為鑒定防治乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移新的分子標(biāo)志物和潛在的重要靶點奠定基礎(chǔ)。