董丹紅，龐璽倬，李 琳

（昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心內科，云南昆明 650032）

心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion，IR）導致嚴重的心律失常、心肌壞死面積擴大、心臟破裂甚至死亡[1]。血管內皮細胞是IR 損傷中重要的靶細胞，是IR 損傷的始發(fā)及重要影響因素[2]。血管內皮通過其屏障和分泌功能，成為影響心血管疾病發(fā)生、發(fā)展以及再灌注損傷的關鍵環(huán)節(jié)[3]。

缺血后血管內皮損傷以血管內皮依賴性舒張損傷為典型特征，尤以一氧化氮（nitric oxide，NO）介導的血管內皮舒張為代表。內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活化左-精氨酸后產(chǎn)生NO，激活鳥苷酸（GC），產(chǎn)生cGMP，引起cGMP 依賴的蛋白激酶（protein kinase G，PKG）介導的血管舒張 。eNOS/cGMP/PKG 對內皮依賴的舒張有重要作用。cGMP/PKG 信號通路調節(jié)血管內皮細胞的運動、遷移和增殖，對血管新生和血管的通透性及其重要。內皮依賴的血管舒張主要是由eNOS/NO/GC/cGMP/PKG 信號通路介導的，NO/cGMP/PKG 通路在IR 損傷時具有心臟保護作用[4]。課題組研究發(fā)現(xiàn)，PKG 通路與IR 致血管內皮損傷保護作用有關[5]。

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者的重要治療手段，PCI 術后可導致心肌IR 損傷，但是否會導致血管內皮功能損傷及PKG 信號通路在其中的作用，目前尚未見報道。本研究旨在探討ACS 患者PCI 治療與血管內皮功能損傷的關系，以及eNOS/NO/PKG 信號通路的相關因子在其中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究納入2015 年6 月至2016 年1 月收住昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心內科確診為ACS 的患者52 例，均接受冠脈造影術，必要時行PCI 術，住院期間均接受冠心病藥物治療。所有患者按照是否接受PCI 治療分為PCI 組（n=33）和非PCI組（n=19）。入選標準：確診ACS 并行冠脈造影術的患者，ACS 診斷標準參考中國相關指南[6-7]。排除標準：既往發(fā)生過ACS，且在3 個月內接受過PCI 治療；3 個月內發(fā)生過腦梗死、肺栓塞及嚴重阻塞性肺疾??；血流動力學不穩(wěn)定；嚴重的心律失常；有嚴重肝、腎、肺功能損害；嚴重感染；妊娠；依從性差的患者。所有入試者均簽署知情同意書。

1.2 血流介導的血管舒張（flow mediate dilation，F(xiàn)MD）測定

所有患者入院后6 h 及術后24 h（PCI 組為PCI 術后，非PCI 組為冠脈造影術后）采用血管內皮功能檢測儀（上海曙誠醫(yī)療科技發(fā)展有限公司，UNEX EF）測定FMD。患者在安靜狀態(tài)下，取仰臥位，連接心電、血壓監(jiān)測，右上肢外展15°，用機載超聲探頭置于肘上2～5 cm 處尋找并鎖定靶血管（即右上臂肱動脈），取肱動脈縱切面進行掃描，用二維超聲尋找并測量右上肢肱動脈內徑，測值取三個心動周期的平均值。首先測量舒張末期血管內徑（D0），獲得基礎值后，測量患者血壓，并根據(jù)測量的血壓值設定袖帶壓力。阻斷血流過程，袖帶將阻斷肱動脈血流5 min，之后釋放袖帶氣體而引起動脈內反應性充血，在放氣后的60～90 s 內進行掃描，測量肱動脈內徑（D1）。最后根據(jù)公式[（反應后管腔內徑-管腔基礎內徑）/管腔基礎內徑]得出FMD 的值。

1.3 外周血eNOS、NO、PKG 濃度檢測

入院后3 h 及術后6 h 分別抽靜脈血，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，4℃放置30min 后，1 000 r/min，離心15 min，收集血清凍存于-80℃低溫冰箱。采用ELISA 法，分別使用Human eNOS ELISA（NEOBIOLAB，HN0031）、Total Nitric Oxide and Nitrate Nitrite Parameter Assay（R&D，KGE001）和Human PKG ELISA Kit（LSBio，LS-F21271）試劑盒檢測eNOS、亞硝酸鹽和PKG 濃度，按試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例（%）表示，正態(tài)分布的計量資料用（）表示。計數(shù)資料采用χ2檢驗，四格表有理論頻數(shù)小于1 時，采用四格表確切概率法；PCI 術前、術后自身對照采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關性采用Pearson 相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 ACS 患者PCI 組及非PCI 組基線信息比較（）Tab.1 Comparisons of baseline information between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表1 ACS 患者PCI 組及非PCI 組基線信息比較（）Tab.1 Comparisons of baseline information between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

注：LVEF 為左室射血分數(shù)，LVEDD 左心室舒張末期內徑，ACS 為急性冠脈綜合征，ACEI 為血管緊張素轉化酶抑制劑，ARB 為血管緊張素受體拮抗劑。

2 結果

2.1 基線資料比較

PCI 組和非PCI 組患者基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 FMD 比較

PCI 組FMD 值術后較術前降低（P＜0.05），PCI 組較非PCI 組術后FMD 值降低（P＜0.05），見表2。

2.3 eNOS 濃度比較

PCI 組和非PCI 組患者術后較術前eNOS 濃度均下降，差異均有統(tǒng)計學意義，而PCI 組術后較術前降低更明顯（P＜0.05），術后eNOS 濃度PCI 組較非PCI 組降低（P＜0.05），見表3。

2.4 亞硝酸鹽濃度（反映NO 含量）比較

PCI 組亞硝酸鹽濃度術后較術前降低（P＜0.01），術后亞硝酸鹽濃度PCI 組較非PCI 組降低（P＜0.01），見表4。

2.5 PKG 濃度比較及相關性分析

PCI 組PKG 濃度術后較術前顯著降低（P＜0.05），術后PKG 濃度PCI 組較非PCI 組降低（P＜0.05），見表5。PCI 組術前的PKG 濃度與術后FMD 值呈正相關（r=0.478，P=0.005），見圖1。

表2 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術前后FMD 比較（）Tab.2 A comparison of FMD before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients（）

表2 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術前后FMD 比較（）Tab.2 A comparison of FMD before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients（）

與PCI 組手術前比較，*P＜0.05；與非PCI 組手術后比較，△P＜0.05。

表3 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術前后eNOS 濃度比較（）Tab.3 A comparison of eNOS concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表3 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術前后eNOS 濃度比較（）Tab.3 A comparison of eNOS concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

與PCI 組手術前比較，*P＜0.05；與非PCI 組手術后比較，△P＜0.05；與非PCI 組手術前比較，#P＜0.05。

表4 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術前后亞硝酸鹽濃度比較（）Tab.4 A comparison of nitrite concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表4 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術前后亞硝酸鹽濃度比較（）Tab.4 A comparison of nitrite concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

與PCI 組手術前比較，*P＜0.05；與非PCI 組手術后比較，△P＜0.05。

表5 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術前后PKG 濃度比較（）Tab.5 A comparison of PKG concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表5 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術前后PKG 濃度比較（）Tab.5 A comparison of PKG concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

與PCI 組手術前比較，*P＜0.05；與非PCI 組手術后比較，△P＜0.05。

圖1 PCI 組術前PKG 與術后FMD 的相關性Fig.1 Correlation between preoperative PKG and postoperative FMD in PCI group

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，ACS 患者冠狀動脈存在內皮依賴性血管舒張功能異常，此功能異常同時累及周圍動脈，外周動脈和冠狀動脈血管反應一致[8]，肱動脈的內皮功能變化能間接反映冠狀動脈的內皮功能情況。FMD 檢測是目前常用的無創(chuàng)內皮功能檢測方法之一，其主要作用介質是內皮細胞衍生的NO，利用無創(chuàng)高分辨率超聲技術評估外周血管內皮依賴性舒張反應，可間接反映冠狀動脈內皮功能。冠脈支架植入可造成急性冠脈內皮損傷，有時可合并動脈夾層或血腫。正常情況下，血管內皮細胞通過分泌前列環(huán)素和一氧化氮來防止血小板粘附、聚集和活化，并維持促凝（組織因子）、抗凝（肝素、蛋白C/S）和血栓溶解因子（組織纖溶酶原激活劑）之間的平衡。當血管內皮受損或功能失調時，其抗血小板功能減弱，促凝血活性增強；同時伴隨血管收縮，局部血流減少，這些因素可增加支架血栓形成的風險[3]。本研究觀察到ACS 患者中，PCI 組術后FMD 值較術前顯著降低，而非PCI 組無明顯變化；術后FMD 值PCI 組較非PCI 組顯著降低，提示PCI 術后血管內皮功能受損。PCI 組術后血管內皮舒張功能受損，可能與以下因素有關：（1）PCI 術后引起的IR 可直接導致冠狀動脈血管內皮損傷：正常狀態(tài)下，內皮細胞通過合成和釋放多種生物活性物質維持血管功能完整性，但在IR 誘導下血管內皮損傷嚴重，導致冠狀動脈血管張力調節(jié)機能受損，加速冠狀動脈血管壁重塑、促進血小板活化和聚集等，加重心肌IR 損傷[9-10]；（2）手術過程中的機械損傷：PCI行支架植入術前先進行經(jīng)皮冠狀動脈腔內血管成形術，球囊對狹窄/閉塞的冠狀動脈進行機械性擴張及其引起的短暫性缺血，導致冠狀動脈血管內皮細胞損傷；（3）損傷后再生的內皮細胞存在功能異常：手術機械操作造成內皮細胞的損傷或剝脫后，鄰近細胞可出現(xiàn)內皮再生，但損傷后再生的內皮細胞存在內皮依賴性血管舒張能力的降低[3，11]。

研究表明，在血管內皮和心肌中表達的eNOS能夠維持心臟和血管的正常生理功能，通過eNOS產(chǎn)生的NO 對缺血心肌具有保護作用[12-13]。eNOS/NO/GC/cGMP/PKG 信號通路介導內皮依賴的血管舒張，PKG 被認為是最重要的下游靶點[14]。PKG 在多種生理過程中發(fā)揮著核心作用，如調節(jié)血管平滑肌細胞的收縮和舒張、抗高血壓、抗心肌肥大、抗動脈粥樣硬化和抗血管損傷等[15-16]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)燈盞花乙素可促進PKG，尤其是PKG-Iα 表達，從而減輕人心臟微血管內皮細胞IR 損傷[5]，提示PKG 很可能是血管內皮IR 損傷中的一種保護因素，促進其合成可能減輕IR 損傷。本研究觀察到PCI 組術后血清eNOS、亞硝酸鹽濃度（反映NO 量）和PKG 濃度均較非PCI 組顯著降低，提示ACS 患者進行PCI 操作較單純冠脈造影術明顯降低了血清eNOS、NO、PKG 濃度。而組內比較發(fā)現(xiàn)，PCI 組患者術后血清eNOS、亞硝酸鹽和PKG 濃度均較術前顯著降低，而非PCI組術后亞硝酸鹽濃度、PKG 濃度較術前均無明顯下降，雖然非PCI 組eNOS 濃度術后較術前降低，但PCI 組術后降低更顯著。PCI 組患者術前PKG濃度與術后FMD 具有正相關關系，提示PKG 可能對血管內皮功能具有保護作用，PKG 水平高則血管內皮損傷程度相對較輕。

ACS 患者進行PCI 治療后，由于PCI 引起的IR 損傷及機械損傷等原因，使血管內皮功能受損；同時PCI 術后與內皮依賴的血管舒張相關因子eNOS、NO、PKG 濃度也較術前明顯下降，提示ACS 患者PCI 術后血管內皮損傷可能與eNOS、NO及PKG 的降低有關，eNOS/NO/PKG 信號通路可能參與ACS 患者PCI 術后血管內皮保護作用。

本研究結果提示ACS 患者PCI 術可導致血管內皮功能的損傷，其可能與eNOS/NO/PKG 信號通路有關，上調PKG 信號通路可能是拮抗PCI 術后血管內皮損傷的治療靶點。但PKG 信號通路在ACS 患者PCI 術后致血管內皮IR 損傷的具體作用機制，以及eNOS/NO/PKG 信號通路與血管內皮功能之間的因果關系，還需更大樣本的臨床和實驗研究加以驗證。