周金娜，張榮平，鄒 澄，楊為民，何 波，陳德云，段文越

（昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500）

巖白菜素（Bergenin）作為天然的次生代謝產(chǎn)物，來(lái)源于多種植物。巖白菜素屬二氫異香豆素類化合物，過(guò)去尚有巖白菜內(nèi)酯，鬼燈聚素，巖白菜寧，佛手配質(zhì)等異名，溶解性極差[1]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)巖白菜素具有抗炎，抗腫瘤，抗心律失常，鎮(zhèn)咳祛痰等活性[2-5]。巖白菜素的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明其生物利用度較低，為了充分發(fā)揮巖白菜素的藥用價(jià)值，提高其生物利用度以及生物活性，不少研究者對(duì)巖白菜素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造[6-11]，其中，通過(guò)Mannich 反應(yīng)合成的化合物能增加巖白菜素的水溶性及其活性。因此，本文將巖白菜素與芳基重氮鹽反應(yīng)生成新穎偶氮衍生物，且根據(jù)重氮化偶合反應(yīng)機(jī)理，針對(duì)巖白菜素分子中苯環(huán)的7 位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，生成巖白菜素偶氮衍生物。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g。由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

FA2004 電子天平（上海瞬宇恒平科學(xué)儀器有限公司），BUCHIR-200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司），KQ-100E 型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SHZ-DⅢ水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），BrukerAVⅢ-500 型核磁共振波譜儀（美國(guó)Bruker公司），安捷倫6520 系列高分辨Q-TOF-ESI-MS（安捷倫科技有限公司）。

柱層析用硅膠（青島海洋化工廠）；高效薄層層析板（默克）；化學(xué)合成試劑主要為優(yōu)級(jí)純，少量分析純，均購(gòu)買(mǎi)于上海晶純實(shí)業(yè)有限公司（阿拉?。┖蜕虾Ｌ┨箍萍脊煞萦邢薰荆ò⑦_(dá)瑪斯）。

1.2 方法

1.2.1 7-氨基巖白菜素的制備取50 mg 已制備好的7-對(duì)苯砷酸偶氮巖白菜素[11]置于50 mL 雙口圓底燒瓶，加入5 mL 甲醇超聲溶解，溶解完全后常溫?cái)嚢钘l件下加入100 g 鋅粉，通入惰性氣體氬氣保護(hù)反應(yīng)進(jìn)行，另外稱取150 mg 甲酸銨，加入5 mL 甲醇超聲溶解完全后在真空條件下將甲酸銨溶液用10 mL 注射器吸取甲酸銨溶液注射于雙口圓底燒瓶中反應(yīng)，每隔0.5 h 用碘顯色和薄層色譜（TLC）檢查反應(yīng)終點(diǎn)。2 h 反應(yīng)完全后常溫過(guò)濾，減壓蒸餾濾液，經(jīng)300～400 目硅膠柱色譜分離，使用氯仿:乙醇（17:3）進(jìn)行洗脫，得到化合物1，采用核磁共振對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定?；衔? 反應(yīng)途徑見(jiàn)圖1。

圖1 7-氨基巖白菜素的合成Fig.1 Preparation of 7-amino bergenin

1.2.2 鎮(zhèn)咳活性評(píng)價(jià)取小鼠32 只，雌雄各半，隨機(jī)分成4 組（空白組、模型組、供試藥組、和巖白菜素組），每組8 只。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h，各組均灌胃給藥（巖白菜素劑量100 mg/kg），給藥1 h 后，將小鼠置于倒置的500 mL燒杯內(nèi)，用1 mL 注射器吸取濃氨水（25%～28%）0.15 mL 注入燒杯內(nèi)放的棉球中觀察小鼠出現(xiàn)咳嗽的時(shí)間（咳嗽潛伏期）和3min 內(nèi)咳嗽次數(shù)（以小鼠腹肌收縮或縮胸，同時(shí)張嘴為咳嗽指標(biāo)）。

1.2.3 祛痰活性評(píng)價(jià)取小鼠36 只，雌雄各半，隨機(jī)分成3 組（生理鹽水組，巖白菜素組，供試藥組），每組12 只。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。分別灌胃給予藥物組和巖白菜素（100 mg/kg）及生理鹽水（1 mL/200 g）。給藥后0.5 h，腹腔注射0.5%酚紅溶液0.5 mL，30 min 后處死小鼠（盡量不損傷氣管），仰位固定于手術(shù)板上，剪開(kāi)頸正中皮膚，分離氣管，在氣管下穿一絲線，用8 號(hào)針頭于喉頭下插入氣管內(nèi)0.3 cm，絲線結(jié)扎固定，用1 mL 注射器吸取0.5 mL 的5%NaHCO3溶液來(lái)回灌洗呼吸道3 次，將灌洗液注入一比色管中，重新吸取5%NaHCO3溶液0.5 mL 如上再灌洗3 次，再同樣灌洗3 次，如此共抽洗9 次，合并洗出液，離心10 min，取上清液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)546 nm 處測(cè)OD 值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出酚紅排出量（μg/mL），并與對(duì)照組相比。

酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:分別配制標(biāo)準(zhǔn)濃度酚紅溶液，以分光光度計(jì)測(cè)定吸光度（A），以A 對(duì)酚紅含量C 回歸，算得回歸方程。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均使用SPSS 采用單因素方差分析進(jìn)行處理，結(jié)果以（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 波譜數(shù)據(jù)

化合物1，淡黃色油狀物，分子式為C14H17NO9。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：4.97（1H，d，H-10b）; 4.86 （1H，m，H-4a）; 4.03（1H，m，H-4）; 3.98 （1H，m，H-2）; 3.79（1H，m，H-9-OCH3）,3.67 （1H，m，H-11）;3.40 （1H，m，H-3）; 13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ：80.69 （C-2），74.86 （C-3），75.81（C-4），167.92 （C-6），139.09 （C-7），112.25（C-8），142.07（C-9），139.80 （C-10），62.73（C-11），82.87 （C-4a），98.89 （C-6a），111.01（C-10a），60.97 （9-OCH3）71.88 （C-10b），ESI-MS （m/z）:344.10 [M+H]+。經(jīng)分析確定為7-氨基巖白菜素。

2.2 鎮(zhèn)咳活性

各組小鼠咳嗽潛伏期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與空白組相比，模型組3 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)顯著增加，顯示造模成功。與模型組相比，供試藥組小鼠3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著降低（P<0.01）；同時(shí)，與巖白菜素組相比，供試藥組小鼠3min 內(nèi)咳嗽次數(shù)降低（P<0.01），以上結(jié)果表明，7-氨基巖白菜素具有鎮(zhèn)咳活性，見(jiàn)表1。

2.3 祛痰活性

祛痰活性的比較顯示，施加7-氨基巖白菜素后的祛痰活性均顯著優(yōu)于生理鹽水組（P<0.01）；另外，與巖白菜素組相比，供試藥組小鼠氣管酚紅排出量同樣明顯增加（P< 0.05），以上結(jié)果表明，巖7-氨基巖白菜素具有顯著祛痰活性，見(jiàn)表2。

表1 7-氨基巖白菜素對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳活性比較（）Tab.1 A comparison of antitussive effect of 7-amino bergenin on mice （）

表1 7-氨基巖白菜素對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳活性比較（）Tab.1 A comparison of antitussive effect of 7-amino bergenin on mice （）

與模型組比較，**P<0.01，與巖白菜素組比較，##P<0.01。

表2 7-氨基巖白菜素對(duì)小鼠的祛痰活性比較（）Tab.2 A comparison of expectorant effect of 7-amino bergenin on mice （）

表2 7-氨基巖白菜素對(duì)小鼠的祛痰活性比較（）Tab.2 A comparison of expectorant effect of 7-amino bergenin on mice （）

與生理鹽水組比較，**P<0.01，與巖白菜素組比較，#P<0.05。

3 討論

利用偶氮還原方法對(duì)巖白菜素偶氮衍生物進(jìn)行還原，使氮-氮鍵斷裂而生成氨基巖白菜素，這種方法不僅具有步驟少、反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，而且氨基的引入也可能增加巖白菜素的溶解度，從而提高生物利用度、增強(qiáng)其藥理活性。

在設(shè)計(jì)還原巖白菜素偶氮衍生物中，根據(jù)巖白菜素偶氮衍生物及實(shí)驗(yàn)室的條件筆者嘗試使用水合肼（N2H4·H2O）做供氫體，鈀碳（Pb/C）為催化劑在80℃下進(jìn)行還原，但該還原反應(yīng)速度極慢，產(chǎn)率極低；也嘗試使用硫代硫酸鈉（Na2S2O3）在稀NaOH（2 mol/L）條件下進(jìn)行還原，該還原反應(yīng)速度較快，但反應(yīng)溶液放置后接觸空氣后變色氧化，最終我們采取了以甲酸銨作為供氫體、鋅粉（Zn）提供電子在甲醇中還原巖白菜素偶氮衍生物，該方法操作方便、簡(jiǎn)單、原子經(jīng)濟(jì)性高且反應(yīng)基團(tuán)專一。

研究證實(shí)巖白菜素具有鎮(zhèn)咳祛痰的藥理作用[12-14]，研究大多利用氨水引咳法和氣管酚紅排泌法來(lái)觀察巖白菜素對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳祛痰活性[15-16]，方法較為成熟，且容易操作。通過(guò)氨基的引入所得到的衍生物7-氨基巖白菜素，具有顯著的鎮(zhèn)咳祛痰活性。與巖白菜組相比，無(wú)論是鎮(zhèn)咳活性或者是祛痰活性，供試藥組均顯示出較好活性，這為巖白菜素的鎮(zhèn)咳祛痰活性研究提供了的新的研究基礎(chǔ)，也為后續(xù)的巖白菜素結(jié)構(gòu)修飾提供了新的研究方向。