王杰 韓夢(mèng)豪 許琳玉 劉儀云 許家月 陳蘇丹

摘要：為解決款冬生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的問(wèn)題，以款冬幼嫩無(wú)病蟲(chóng)害侵染的葉片為試材，采用組培快繁技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行離體培養(yǎng)，包括誘導(dǎo)愈傷組織、葉片增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化移栽4個(gè)過(guò)程。結(jié)果表明：最適誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+2mg/LNAA，最適芽增殖分化培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L NAA+2.0mg/L zT，最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5mg/L NAA，最適移栽基質(zhì)為珍珠巖：蛭石：泥炭土=3：1：6。

關(guān)鍵詞：款冬;組織培養(yǎng);愈傷組織;馴化移栽

款冬（Tussilago farfara L）為菊科款冬屬多年生草本植物，別名冬花、九九花，頭狀花序，花期2～3月?？疃槲覈?guó)傳統(tǒng)中藥材，歷代《中國(guó)藥典》均有收載。其性溫、味辛、微苦、歸肺經(jīng)，具有平喘、升壓、抗炎、抗腫等功效，臨床使用十分廣泛。近幾年，環(huán)境污染所帶來(lái)的一系列問(wèn)題成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，尤其是霧霾天氣引發(fā)的健康問(wèn)題更是令人焦慮。人體吸入空氣中的雜質(zhì)和有毒氣體，導(dǎo)致咳嗽、呼吸困難等呼吸道疾病，嚴(yán)重影響著人們的身體健康。研究表明，款冬能有效地緩解上述并發(fā)癥，有止咳、化痰、潤(rùn)肺之功效。但目前款冬花野生資源遭受?chē)?yán)重的破壞，且人工栽培周期長(zhǎng)，種植面積少，導(dǎo)致市場(chǎng)供不應(yīng)求。本試驗(yàn)以款冬為試材，建立完整組培體系，以期為進(jìn)一步的工廠化、規(guī)?；a(chǎn)育苗提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2018年9月～2019年6月在河南省洛陽(yáng)市河南科技大學(xué)（112°24E，34°35N，）進(jìn)行。洛陽(yáng)市位于暖溫帶地帶，屬大陸性氣候。洛陽(yáng)市年平均溫度為11～24%，與款冬天然生長(zhǎng)氣候環(huán)境大致相同。

1.2試驗(yàn)材料

款冬采集于河南省三門(mén)峽市盧氏縣，并移栽至河南科技大學(xué)開(kāi)元校區(qū)統(tǒng)一管理。

1.3方法

1.3.1葉片的消毒處理。試驗(yàn)采用生長(zhǎng)旺盛、無(wú)病蟲(chóng)害侵染的幼嫩葉片。先用淡洗衣粉水浸泡5min，輕微攪拌，然后流水沖洗0.5h，除去殘余。款冬葉片表面覆蓋細(xì)小絨毛，滅菌較為困難，因此用棉簽輕輕擦拭表面可以使消毒劑達(dá)到良好效果。本試驗(yàn)設(shè)置75%乙醇、0.1g/L HgCI2分別處理30s、300s。

1.3.2培養(yǎng)條件。選用MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入濃度為30g/L蔗糖，8g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值5.6～6.4。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度2500～3100Lx，光照時(shí)間12hid，培養(yǎng)溫度22±3℃。

1.3.3誘導(dǎo)愈傷組織。將處理好的葉片在超凈工作臺(tái)上切成約1cm²的小正方形，接種于附加不同激素濃度6-BA、NAA的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每組接種30瓶，每瓶接種3小塊葉片，在22±3℃光培養(yǎng)40d，誘導(dǎo)期間觀察其生長(zhǎng)情況。

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L），NAA（0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L）共9組處理，上述各處理培養(yǎng)基均添加適量30g/L蔗糖、7g/L瓊脂。培養(yǎng)基pH值5.6～6.4。

1.3.4芽的增殖培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)良好的愈傷組織進(jìn)行芽的增殖分化，將其接入附加不同濃度6一BA、NAA、zT的培養(yǎng)基上。每組處理接種30瓶，每瓶接種1塊愈傷組織。在22±3℃、光周期12h/12h（光，暗）的條件下培養(yǎng)30d，培養(yǎng)期間觀察其芽的增殖情況。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA（1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L），NAA（0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L），ZT（1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L）共8組處理，上述各處理培養(yǎng)基均添加適量30g/L蔗糖，7g/L瓊脂。培養(yǎng)基pH值5.6～6.4。1.3.5生根培養(yǎng)。選取健壯飽滿(mǎn)的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度NAA（0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L），每組處理均添加0.5%活性炭，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH值5.6～6.4，培養(yǎng)30d，期間觀察根的生長(zhǎng)情況。

1.3.6馴化移栽。將根長(zhǎng)勢(shì)健壯的組培苗移人室溫中，在1周之內(nèi)將其瓶蓋慢慢打開(kāi)，再完全打開(kāi)放置2～3d，取出苗洗凈根部培養(yǎng)基。在4%高錳酸鉀溶液中浸泡根部10s，移栽至珍珠巖：蛭石：泥炭土=1：1：1與珍珠巖：蛭石：泥炭土=3：1：6的2種不同基質(zhì)配比中，每組處理10瓶。保持溫度22±3℃，含水量（95±5）%，適當(dāng)遮蔭與通風(fēng)，計(jì)算成活率。

2結(jié)果與分析

2.1不同植物激素對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響

接種3周后觀察，葉片四周有明顯膨大卷曲現(xiàn)象，大部分葉片邊緣形成黃綠色的凸起物。1mg/L 6-BA濃度中長(zhǎng)勢(shì)最好;濃度為1.5mg/L 6-BA培養(yǎng)基中出現(xiàn)少量“燒苗”現(xiàn)象。在第6周觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，濃度為0.5mg/L6-BA愈傷組織較致密，但長(zhǎng)勢(shì)弱，不具備芽的增殖分化能力;濃度為1.5mg/L 6-BA出現(xiàn)“燒苗”現(xiàn)象;濃度為1.0mg/L 6-BA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織致密;濃度為1.0mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA最為突出，愈傷組織呈現(xiàn)出顏色淡黃綠色，致密且強(qiáng)壯。經(jīng)分析表明，MS+I.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA是較為理想的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為90.2%，愈傷組織呈黃綠色，強(qiáng)壯且致密，有較強(qiáng)的芽增殖分化能力。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

2.2不同植物激素對(duì)芽的增殖分化的影響

將長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)入芽的增殖分化培養(yǎng)基上，2周之后觀察并記錄其芽誘導(dǎo)率。如表2所示，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的6-BA和ZT分別和NAA配比，在一定的濃度范圍內(nèi)，芽的誘導(dǎo)率均呈現(xiàn)先上升后下降。以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA的培養(yǎng)基，芽數(shù)量多且健壯，基部無(wú)或有少量愈傷組織，生長(zhǎng)情況良好，誘導(dǎo)率最高達(dá)65.21%。

2.3不同植物激素對(duì)生根培養(yǎng)的影響

當(dāng)芽長(zhǎng)到3cm左右，移人生根培養(yǎng)基，20d后根長(zhǎng)有明顯的伸長(zhǎng)情況。在第4周時(shí)對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行觀察記錄。如表3所示，濃度為0.1mg/L NAA時(shí)平均根長(zhǎng)最短且根較弱;濃度為0.5mg/L NAA時(shí)平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)且根較健壯，達(dá)3.2cm;濃度為1.0m～LNAA時(shí)試管苗平均根長(zhǎng)達(dá)2.6cm，且大部分培養(yǎng)基中存在少量愈傷組織。以上結(jié)果表明，誘導(dǎo)試管苗生根最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5%活性炭，試管苗平均根長(zhǎng)為3.2cm，根生長(zhǎng)健壯，根部無(wú)或有少量愈傷組織。

2.4不同基質(zhì)配比對(duì)馴化移栽影響

當(dāng)平均根長(zhǎng)達(dá)到3.2cm時(shí)，對(duì)其進(jìn)行馴化移栽，30天后觀察并記錄成活率。如表4所示，發(fā)現(xiàn)2種基質(zhì)都較為適合試管苗的移栽，但珍珠巖：蛭石：泥炭土=3：1：6的基質(zhì)成活率更高。

3結(jié)論與討論

在處理款冬葉片時(shí)，因其背部覆細(xì)小絨毛，會(huì)影響消毒劑的消毒效果，需用棉簽擦拭表面，還可將吐溫-80加入75%酒精進(jìn)行處理。兩者相比，棉簽使用更方便，去除絨毛較徹底，效果更明顯。在款冬葉片誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)期，得出適宜的培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA，與王貴軍試驗(yàn)結(jié)果相比較，其誘導(dǎo)愈傷組織最適培養(yǎng)基為MS+I.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。兩者結(jié)果有較小的差異，其原因可能為款冬的產(chǎn)地不同，生長(zhǎng)環(huán)境不同，栽培種類(lèi)不同。在此期間發(fā)現(xiàn)，部分愈傷組織出現(xiàn)“褐化”現(xiàn)象，出現(xiàn)“褐化”的原因與品種、培養(yǎng)基、取材季節(jié)等都有一定關(guān)系，其嚴(yán)重程度與酚類(lèi)化合物的代謝有關(guān)，酚類(lèi)化合物含量越高，“褐化”現(xiàn)象越嚴(yán)重。植物激素NAA可以在一定程度上阻礙酚類(lèi)化合物的合成，緩解“褐化”的程度。

在芽的增殖分化時(shí)期，本試驗(yàn)采用2種不同培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，一種是以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度配比的NAA與6-BA，一種是以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度比例的NAA與ZT。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2種培養(yǎng)基在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)芽的增殖分化都有一定的促進(jìn)作用，但以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA生長(zhǎng)效果最好，試驗(yàn)結(jié)果與任繼文等的報(bào)道結(jié)果類(lèi)似。

在生根培養(yǎng)中得出最適培養(yǎng)基為I/2MS+0.5mg/LNAA+0.5%活性炭，與王貴軍研究報(bào)道結(jié)果相同?；|(zhì)的種類(lèi)及其配比是影響款冬組培苗馴化移栽生長(zhǎng)的重要因子，泥炭土具有巨大的吸水與保水能力，珍珠巖穩(wěn)定性強(qiáng)，吸水性好，可以疏松土壤使根系透氣。蛭石透氣性好，溫度變化小，有利于穩(wěn)定根系的環(huán)境溫度。采用這3種基質(zhì)有利于款冬的生長(zhǎng)。從此次試驗(yàn)得出，馴化移栽最適基質(zhì)比例為珍珠巖：蛭石：泥炭土=3：1：6，成活率高達(dá)89.72%，這與韋如萍研究結(jié)果不同。出現(xiàn)差異的原因是不同科屬的植物生長(zhǎng)習(xí)性不同，對(duì)需水量及需氧量不同，所以對(duì)不同基質(zhì)的需求量不同。

本試驗(yàn)建立了完整的款冬組培體系，極大地縮短了其栽培周期，為工廠化育苗提供理論依據(jù)，在一定程度上可緩解款冬野生資源緊張，滿(mǎn)足市場(chǎng)的巨大需求。

（收稿：2019-09-16）