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        款冬組培快繁技術(shù)研究

        2020-08-11 14:28:45王杰韓夢(mèng)豪許琳玉劉儀云許家月陳蘇丹
        現(xiàn)代園藝·綜合版 2020年3期
        關(guān)鍵詞:愈傷組織組織培養(yǎng)

        王杰 韓夢(mèng)豪 許琳玉 劉儀云 許家月 陳蘇丹

        摘要:為解決款冬生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的問(wèn)題,以款冬幼嫩無(wú)病蟲(chóng)害侵染的葉片為試材,采用組培快繁技術(shù),對(duì)其進(jìn)行離體培養(yǎng),包括誘導(dǎo)愈傷組織、葉片增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化移栽4個(gè)過(guò)程。結(jié)果表明:最適誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+2mg/LNAA,最適芽增殖分化培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L NAA+2.0mg/L zT,最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5mg/L NAA,最適移栽基質(zhì)為珍珠巖:蛭石:泥炭土=3:1:6。

        關(guān)鍵詞:款冬;組織培養(yǎng);愈傷組織;馴化移栽

        款冬(Tussilago farfara L)為菊科款冬屬多年生草本植物,別名冬花、九九花,頭狀花序,花期2~3月??疃槲覈?guó)傳統(tǒng)中藥材,歷代《中國(guó)藥典》均有收載。其性溫、味辛、微苦、歸肺經(jīng),具有平喘、升壓、抗炎、抗腫等功效,臨床使用十分廣泛。近幾年,環(huán)境污染所帶來(lái)的一系列問(wèn)題成為人們關(guān)注的熱點(diǎn),尤其是霧霾天氣引發(fā)的健康問(wèn)題更是令人焦慮。人體吸入空氣中的雜質(zhì)和有毒氣體,導(dǎo)致咳嗽、呼吸困難等呼吸道疾病,嚴(yán)重影響著人們的身體健康。研究表明,款冬能有效地緩解上述并發(fā)癥,有止咳、化痰、潤(rùn)肺之功效。但目前款冬花野生資源遭受?chē)?yán)重的破壞,且人工栽培周期長(zhǎng),種植面積少,導(dǎo)致市場(chǎng)供不應(yīng)求。本試驗(yàn)以款冬為試材,建立完整組培體系,以期為進(jìn)一步的工廠化、規(guī)?;a(chǎn)育苗提供理論依據(jù)。

        1材料與方法

        1.1試驗(yàn)地概況

        試驗(yàn)于2018年9月~2019年6月在河南省洛陽(yáng)市河南科技大學(xué)(112°24E,34°35N,)進(jìn)行。洛陽(yáng)市位于暖溫帶地帶,屬大陸性氣候。洛陽(yáng)市年平均溫度為11~24%,與款冬天然生長(zhǎng)氣候環(huán)境大致相同。

        1.2試驗(yàn)材料

        款冬采集于河南省三門(mén)峽市盧氏縣,并移栽至河南科技大學(xué)開(kāi)元校區(qū)統(tǒng)一管理。

        1.3方法

        1.3.1葉片的消毒處理。試驗(yàn)采用生長(zhǎng)旺盛、無(wú)病蟲(chóng)害侵染的幼嫩葉片。先用淡洗衣粉水浸泡5min,輕微攪拌,然后流水沖洗0.5h,除去殘余。款冬葉片表面覆蓋細(xì)小絨毛,滅菌較為困難,因此用棉簽輕輕擦拭表面可以使消毒劑達(dá)到良好效果。本試驗(yàn)設(shè)置75%乙醇、0.1g/L HgCI2分別處理30s、300s。

        1.3.2培養(yǎng)條件。選用MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中加入濃度為30g/L蔗糖,8g/L瓊脂,培養(yǎng)基pH值5.6~6.4。培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度2500~3100Lx,光照時(shí)間12hid,培養(yǎng)溫度22±3℃。

        1.3.3誘導(dǎo)愈傷組織。將處理好的葉片在超凈工作臺(tái)上切成約1cm2的小正方形,接種于附加不同激素濃度6-BA、NAA的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每組接種30瓶,每瓶接種3小塊葉片,在22±3℃光培養(yǎng)40d,誘導(dǎo)期間觀察其生長(zhǎng)情況。

        以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的6-BA(0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L),NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L)共9組處理,上述各處理培養(yǎng)基均添加適量30g/L蔗糖、7g/L瓊脂。培養(yǎng)基pH值5.6~6.4。

        1.3.4芽的增殖培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)良好的愈傷組織進(jìn)行芽的增殖分化,將其接入附加不同濃度6一BA、NAA、zT的培養(yǎng)基上。每組處理接種30瓶,每瓶接種1塊愈傷組織。在22±3℃、光周期12h/12h(光,暗)的條件下培養(yǎng)30d,培養(yǎng)期間觀察其芽的增殖情況。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的6-BA(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L),NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L),ZT(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L)共8組處理,上述各處理培養(yǎng)基均添加適量30g/L蔗糖,7g/L瓊脂。培養(yǎng)基pH值5.6~6.4。1.3.5生根培養(yǎng)。選取健壯飽滿(mǎn)的芽進(jìn)行生根培養(yǎng),以MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度NAA(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L),每組處理均添加0.5%活性炭,30g/L蔗糖,7g/L瓊脂,pH值5.6~6.4,培養(yǎng)30d,期間觀察根的生長(zhǎng)情況。

        1.3.6馴化移栽。將根長(zhǎng)勢(shì)健壯的組培苗移人室溫中,在1周之內(nèi)將其瓶蓋慢慢打開(kāi),再完全打開(kāi)放置2~3d,取出苗洗凈根部培養(yǎng)基。在4%高錳酸鉀溶液中浸泡根部10s,移栽至珍珠巖:蛭石:泥炭土=1:1:1與珍珠巖:蛭石:泥炭土=3:1:6的2種不同基質(zhì)配比中,每組處理10瓶。保持溫度22±3℃,含水量(95±5)%,適當(dāng)遮蔭與通風(fēng),計(jì)算成活率。

        2結(jié)果與分析

        2.1不同植物激素對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響

        接種3周后觀察,葉片四周有明顯膨大卷曲現(xiàn)象,大部分葉片邊緣形成黃綠色的凸起物。1mg/L 6-BA濃度中長(zhǎng)勢(shì)最好;濃度為1.5mg/L 6-BA培養(yǎng)基中出現(xiàn)少量“燒苗”現(xiàn)象。在第6周觀察時(shí)發(fā)現(xiàn),濃度為0.5mg/L6-BA愈傷組織較致密,但長(zhǎng)勢(shì)弱,不具備芽的增殖分化能力;濃度為1.5mg/L 6-BA出現(xiàn)“燒苗”現(xiàn)象;濃度為1.0mg/L 6-BA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織致密;濃度為1.0mg/L 6-BA,0.2mg/L NAA最為突出,愈傷組織呈現(xiàn)出顏色淡黃綠色,致密且強(qiáng)壯。經(jīng)分析表明,MS+I.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA是較為理想的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基,誘導(dǎo)率為90.2%,愈傷組織呈黃綠色,強(qiáng)壯且致密,有較強(qiáng)的芽增殖分化能力。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

        2.2不同植物激素對(duì)芽的增殖分化的影響

        將長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)入芽的增殖分化培養(yǎng)基上,2周之后觀察并記錄其芽誘導(dǎo)率。如表2所示,試驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度的6-BA和ZT分別和NAA配比,在一定的濃度范圍內(nèi),芽的誘導(dǎo)率均呈現(xiàn)先上升后下降。以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA的培養(yǎng)基,芽數(shù)量多且健壯,基部無(wú)或有少量愈傷組織,生長(zhǎng)情況良好,誘導(dǎo)率最高達(dá)65.21%。

        2.3不同植物激素對(duì)生根培養(yǎng)的影響

        當(dāng)芽長(zhǎng)到3cm左右,移人生根培養(yǎng)基,20d后根長(zhǎng)有明顯的伸長(zhǎng)情況。在第4周時(shí)對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行觀察記錄。如表3所示,濃度為0.1mg/L NAA時(shí)平均根長(zhǎng)最短且根較弱;濃度為0.5mg/L NAA時(shí)平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)且根較健壯,達(dá)3.2cm;濃度為1.0m~LNAA時(shí)試管苗平均根長(zhǎng)達(dá)2.6cm,且大部分培養(yǎng)基中存在少量愈傷組織。以上結(jié)果表明,誘導(dǎo)試管苗生根最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5%活性炭,試管苗平均根長(zhǎng)為3.2cm,根生長(zhǎng)健壯,根部無(wú)或有少量愈傷組織。

        2.4不同基質(zhì)配比對(duì)馴化移栽影響

        當(dāng)平均根長(zhǎng)達(dá)到3.2cm時(shí),對(duì)其進(jìn)行馴化移栽,30天后觀察并記錄成活率。如表4所示,發(fā)現(xiàn)2種基質(zhì)都較為適合試管苗的移栽,但珍珠巖:蛭石:泥炭土=3:1:6的基質(zhì)成活率更高。

        3結(jié)論與討論

        在處理款冬葉片時(shí),因其背部覆細(xì)小絨毛,會(huì)影響消毒劑的消毒效果,需用棉簽擦拭表面,還可將吐溫-80加入75%酒精進(jìn)行處理。兩者相比,棉簽使用更方便,去除絨毛較徹底,效果更明顯。在款冬葉片誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)期,得出適宜的培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA,與王貴軍試驗(yàn)結(jié)果相比較,其誘導(dǎo)愈傷組織最適培養(yǎng)基為MS+I.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。兩者結(jié)果有較小的差異,其原因可能為款冬的產(chǎn)地不同,生長(zhǎng)環(huán)境不同,栽培種類(lèi)不同。在此期間發(fā)現(xiàn),部分愈傷組織出現(xiàn)“褐化”現(xiàn)象,出現(xiàn)“褐化”的原因與品種、培養(yǎng)基、取材季節(jié)等都有一定關(guān)系,其嚴(yán)重程度與酚類(lèi)化合物的代謝有關(guān),酚類(lèi)化合物含量越高,“褐化”現(xiàn)象越嚴(yán)重。植物激素NAA可以在一定程度上阻礙酚類(lèi)化合物的合成,緩解“褐化”的程度。

        在芽的增殖分化時(shí)期,本試驗(yàn)采用2種不同培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),一種是以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度配比的NAA與6-BA,一種是以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度比例的NAA與ZT。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2種培養(yǎng)基在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)芽的增殖分化都有一定的促進(jìn)作用,但以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA生長(zhǎng)效果最好,試驗(yàn)結(jié)果與任繼文等的報(bào)道結(jié)果類(lèi)似。

        在生根培養(yǎng)中得出最適培養(yǎng)基為I/2MS+0.5mg/LNAA+0.5%活性炭,與王貴軍研究報(bào)道結(jié)果相同?;|(zhì)的種類(lèi)及其配比是影響款冬組培苗馴化移栽生長(zhǎng)的重要因子,泥炭土具有巨大的吸水與保水能力,珍珠巖穩(wěn)定性強(qiáng),吸水性好,可以疏松土壤使根系透氣。蛭石透氣性好,溫度變化小,有利于穩(wěn)定根系的環(huán)境溫度。采用這3種基質(zhì)有利于款冬的生長(zhǎng)。從此次試驗(yàn)得出,馴化移栽最適基質(zhì)比例為珍珠巖:蛭石:泥炭土=3:1:6,成活率高達(dá)89.72%,這與韋如萍研究結(jié)果不同。出現(xiàn)差異的原因是不同科屬的植物生長(zhǎng)習(xí)性不同,對(duì)需水量及需氧量不同,所以對(duì)不同基質(zhì)的需求量不同。

        本試驗(yàn)建立了完整的款冬組培體系,極大地縮短了其栽培周期,為工廠化育苗提供理論依據(jù),在一定程度上可緩解款冬野生資源緊張,滿(mǎn)足市場(chǎng)的巨大需求。

        (收稿:2019-09-16)

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