胡金華，杜 言，李小敏，胡志雄,2，張維農(nóng),2，齊玉堂，2，張燕鵬,2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023； 2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢輕工大學(xué))，武漢 430023)

氯丙醇類物質(zhì)作為一種食品污染物近年來受到廣泛關(guān)注，該類污染物在食品生產(chǎn)過程中中以3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)生成量最多，因而3-MCPD被作為一種主要指標(biāo)以反映食品加工過程中氯丙醇類物質(zhì)的形成狀況[1]。1995年，歐共體委員會(huì)食品科學(xué)分會(huì)對(duì)氯丙醇類物質(zhì)的毒理作出評(píng)價(jià)，認(rèn)為其是一種致癌物；FDA建議食物含3-MPCD水平不應(yīng)超過1 mg/kg(干基)；2001年，歐盟制定了限量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定3-MPCD不得超過每日2 μg/kg的攝入量[2]。因此，開發(fā)高靈敏的3-MCPD分析方法對(duì)食品中3-MCPD污染殘留進(jìn)行監(jiān)控具有重要意義。

目前，3-MCPD的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(capillary electrophoresis，CE)[3-4]、分子印跡(molecular imprinting，MIP)[5-6]等。其中基于GC的分析方法使用最為普遍, 為了便于檢測(cè)，通常需要對(duì)3-MCPD 進(jìn)行衍生化處理，常用的衍生化試劑主要有酮類(丙酮、丁酮、庚酮)[7]、硼酸類(丁基硼酸、苯硼酸)[8-11]、N,O-雙三甲基-三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA)[12]、三氟乙酸酐(trifluoroacetic anhydride，TFAA)、七氟丁酰咪唑(heptafluorobutyrylimidazole，HFBI、heptafluorobutyric anhydride，HFBA)等[13-17]。該類方法在實(shí)際應(yīng)用中仍存在不少問題, 如儀器設(shè)備條件要求高，分析所使用的氘代衍生化試劑比較昂貴, 以及衍生化試劑穩(wěn)定性較差等。而采用CE和MIP等方法檢測(cè)時(shí)，由于3-MCPD的光譜性能較差、相對(duì)分子質(zhì)量小，使得檢測(cè)靈敏度較低。

本課題組在綜合分析3-MCPD結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，利用Malaprade反應(yīng)，建立了一種腺嘌呤(Ade)柱前衍生化HPLC-FLD定量檢測(cè)3-MCPD含量的分析方法，其檢測(cè)原理如圖1所示。

圖1 腺嘌呤柱前衍生化-HPLC-FLD法檢測(cè)3-MCPD原理[18]

3-MCPD結(jié)構(gòu)中含有鄰二醇基團(tuán)，經(jīng)高碘酸鈉氧化裂解后可生成氯乙醛和甲醛，而氯乙醛與腺嘌呤(Ade)衍生化后生成強(qiáng)熒光物質(zhì)——1,N6-亞乙烯基腺嘌呤(ε-Ade)，可用HPLC-FLD檢測(cè)，根據(jù)ε-Ade的檢測(cè)結(jié)果可間接定性定量檢測(cè)3-MCPD的含量。該法由于使用了熒光檢測(cè)器，具有良好的檢測(cè)靈敏度與選擇性，另外因?yàn)槠漕A(yù)處理、衍生化過程均在水相中進(jìn)行，使得操作也極為簡(jiǎn)便。本文在前期工作基礎(chǔ)上，對(duì)衍生化產(chǎn)物的熒光光譜特點(diǎn)進(jìn)行了較深入的研究，對(duì)液相色譜流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得較佳色譜檢測(cè)條件，進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度與適應(yīng)性。最后采用優(yōu)化的檢測(cè)條件對(duì)6種常見植物油樣品中3-MCPD的含量進(jìn)行了檢測(cè)分析，以拓寬該方法的應(yīng)用范圍，同時(shí)為油脂生產(chǎn)企業(yè)與質(zhì)量監(jiān)督部門提供一種測(cè)定3-MCPD的新思路與新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆油、玉米油、花生油、稻米油、菜籽油、山茶油，武漢某超市購(gòu)買；3-MCPD(97%)、氯乙醛二乙縮醛(99.0%)、三水醋酸鉛(99.9%)，阿拉丁試劑公司；腺嘌呤(99.0%)、純水(質(zhì)譜級(jí))，百靈威試劑公司；濃鹽酸(98%)、高碘酸鈉、亞硫酸鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、無水乙醇(色譜級(jí))、甲醇、正庚烷、乙酸乙酯，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；pH 4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(8.82 mL 0.2 mol/L Na2HPO4+ 11.18 mL 0.1 mol/L檸檬酸配制)，腺嘌呤衍生化試劑用該緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.2 儀器與設(shè)備

萬分之一電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；PHS-3C 雷磁pH計(jì)，上海精科電子有限公司；SK3300超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)，美國(guó)瓦里安儀器有限公司；ESI/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；安捷倫1260高效液相色譜儀，日本島津公司； InertSustainTMC18 色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，日本GL Sciences公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氯乙醛二乙縮醛水解制備氯乙醛[19]

量取5 mL(約32 mmol)氯乙醛二乙縮醛于50 mL圓底燒瓶中，加入15 mL 1.0 mol/L鹽酸和5 mL無水乙醇，混勻后于70℃水浴中攪拌、回流反應(yīng)2 h，冷卻至室溫后，用pH 4.5 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋、定容至32 mL，配制1.0 mol/L氯乙醛溶液，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 3-MCPD溶液的高碘酸鈉氧化裂解預(yù)處理與熒光衍生化

移取3.0 mL 3-MCPD溶液于5 mL離心管中，加入0.15 mL 250 mmol/L高碘酸鈉溶液，避光反應(yīng)30 min后，加入0.15 mL 250 mmol/L亞硫酸鈉溶液反應(yīng)20 min，取2.2 mL處理過的溶液，加入0.2 mL 16.0 mg/mL腺嘌呤溶液，在90℃下反應(yīng)3 h，然后冷卻至室溫，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后進(jìn)HPLC-FLD檢測(cè)。

1.2.3 HPLC-FLD分析條件

InertSustainTMC18 色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動(dòng)相為甲醇/碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液 (pH 9.0) (體積比20∶80)溶液，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL， 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)236.0 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng) 405.0 nm。

1.2.4 衍生化產(chǎn)物的熒光光譜及影響因素研究

取2.0 mL稀釋至0.1 mol/L的氯乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入0.5 mL 0.1 mol/L腺嘌呤溶液，按1.2.2方法衍生化處理后，使用HPLC于紫外波長(zhǎng)280 nm處進(jìn)行分離(甲醇-水體系流動(dòng)相，體積比15∶85)，在衍生化產(chǎn)物的色譜峰處(17.5 min)將其流出液接出，接出液稀釋后采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。為了研究HPLC分析條件下流動(dòng)相pH、有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)、離子強(qiáng)度對(duì)衍生化產(chǎn)物熒光性能的影響，將接出液取0.1 mL，分別加入不同溶液2.0 mL，混合均勻，以調(diào)節(jié)接出液的pH、有機(jī)溶劑甲醇體積分?jǐn)?shù)和離子強(qiáng)度，然后掃描其激發(fā)光譜與發(fā)射光譜，記錄最佳測(cè)定波長(zhǎng)條件下的熒光強(qiáng)度，并繪制相應(yīng)變化規(guī)律曲線。

1.2.5 方法評(píng)價(jià)

1.2.5.1 可行性評(píng)價(jià)——檢測(cè)體系背景與可能干擾物的影響

背景對(duì)照實(shí)驗(yàn)處理方法：磷酸鹽緩沖液體系按1.2.2方法以純水代替3-MCPD溶液、磷酸鹽緩沖液代替腺嘌呤溶液進(jìn)行處理；腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液(不加熱)和腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液(加熱)體系則分別按1.2.2 方法以純水代替3-MCPD溶液、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液加入后不加熱或90℃加熱反應(yīng)3 h。

干擾物比較實(shí)驗(yàn)處理方法：1.0 μg/mL甲醛、1.0 μg/mL 乙醛、200.0 ng/mL氯乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液分別量取2.2 mL，加入0.2 mL腺嘌呤溶液衍生化反應(yīng)；純水、1.0 μg/mL甘油、1.0 μg/mL 1,2-丙二醇溶液與80.0 ng/mL 3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)溶液則按1.2.2方法的步驟進(jìn)行處理。

1.2.5.2 方法的定量性能評(píng)價(jià)

配制1.0～500.0 ng/mL 的3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2方法進(jìn)行衍生化處理后，采用1.2.3的分析條件進(jìn)行檢測(cè)，以ε-Ade的峰面積為縱坐標(biāo)，3-MCPD質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.6 食用油中游離3-MCPD的測(cè)定

1.2.6.1 食用油樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

取150 mL油樣溶于300 mL正庚烷，加入100 mL氯化鈉溶液(0.01 g/mL)，慢速攪拌萃取0.5 h后，靜置分層并棄去下層水相，重復(fù)處理4次后，各取上層油相30 mL，分別加入2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L 3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)溶液(乙酸乙酯作溶劑)10 μL，渦旋混勻作為加標(biāo)樣品，加入6.0 mL 0.01 g/mL氯化鈉溶液后，磁力攪拌20 min，靜置分層后分出下層水相3.0 mL待測(cè)。

1.2.6.2 食用油樣品中3-MCPD的萃取處理

準(zhǔn)確量取32.0 g食用油(體積約為35 mL)置于150 mL 三角瓶中，加入70.0 mL正庚烷進(jìn)行稀釋。攪拌均勻后，取30.0 mL混合油樣置于100 mL燒杯中，加入6.0 mL 0.01 g/mL氯化鈉溶液后，磁力攪拌20 min，靜置分層后分出下層水相3.0 mL待測(cè)，每種食用油準(zhǔn)備3組平行處理樣品。

1.2.6.3 食用油中游離3-MCPD氧化裂解預(yù)處理與熒光衍生化

移取3.0 mL油脂萃取的下層水相溶液于5 mL離心管中，加入0.15 mL 250 mmol/L高碘酸鈉溶液，避光反應(yīng)30 min后，加入0.15 mL 250 mmol/L亞硫酸鈉溶液反應(yīng)20 min，再加入275 mmol/L的醋酸鉛溶液0.15 mL，渦旋振蕩混勻，5℃靜置10 min后，3 000 r/min離心10 min，取2.2 mL上層清液，按1.2.2方法進(jìn)行熒光衍生化，再按1.2.3條件進(jìn)行HPLC-FLD測(cè)定分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 6.0繪圖軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化產(chǎn)物ε-Ade的熒光光譜及影響因素優(yōu)化

2.1.1ε-Ade的熒光光譜

熒光檢測(cè)波長(zhǎng)的設(shè)定對(duì)于HPLC-FLD方法的檢測(cè)靈敏度至關(guān)重要。為此，本實(shí)驗(yàn)按1.2.4方法，將較高濃度條件下制備的衍生化溶液在280 nm下分離后，接出ε-Ade色譜峰的流出液，稀釋后進(jìn)行熒光光譜測(cè)定，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，ε-Ade的最佳熒光發(fā)射波長(zhǎng)為405 nm，而激發(fā)光譜則出現(xiàn)236 nm和276 nm兩處激發(fā)峰，并且276 nm處的熒光強(qiáng)度大于236 nm處的熒光強(qiáng)度，這可能與ε-Ade 在溶液中的存在形態(tài)有關(guān)，為了對(duì)這一現(xiàn)象深入探索，本實(shí)驗(yàn)研究了pH與ε-Ade的熒光強(qiáng)度之間的變化規(guī)律。

圖2 ε-Ade的熒光激發(fā)光譜(實(shí)線)和發(fā)射光譜(虛線)

2.1.2 pH對(duì)ε-Ade熒光性能的影響

按1.2.4方法，用pH 2.2～13.0的緩沖液(磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 2.2～8.0)、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.0～11.0)、磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 12.0)、氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液(pH 13.0))調(diào)節(jié)色譜峰流出液pH，測(cè)定在最大發(fā)射波長(zhǎng)405.0 nm處的熒光激發(fā)光譜，結(jié)果見圖3。

由圖3可見：溶液pH較低(pH<4.0)時(shí)，基本上只出現(xiàn)一個(gè)較弱的激發(fā)峰(λEx= 276.0 nm)，這與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的激發(fā)波長(zhǎng)基本一致，隨著pH的遞增，在236.0 nm波長(zhǎng)處逐漸出現(xiàn)另一個(gè)激發(fā)峰，形成雙峰形態(tài)，并且兩峰的熒光強(qiáng)度均隨著pH的升高而增強(qiáng)，236.0 nm處的峰強(qiáng)增強(qiáng)速度大于276.0 nm處的激發(fā)峰，pH 為8.0時(shí)，兩峰強(qiáng)基本相等，此后，隨著pH的繼續(xù)升高，236.0 nm處峰強(qiáng)均大于276.0 nm處峰強(qiáng)。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能與ε-Ade在溶液中的存在形態(tài)有關(guān)，當(dāng)pH較低(pH<4.0)時(shí)，ε-Ade分子中6位N原子中的n電子質(zhì)子化，質(zhì)子化的ε-Ade只在276.0 nm附近產(chǎn)生一個(gè)激發(fā)峰，其共軛程度減弱導(dǎo)致相應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)均出現(xiàn)一定程度的藍(lán)移；隨著pH的升高，ε-Ade逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹行孕螒B(tài)，共軛程度不斷增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度隨之逐漸增強(qiáng)，另外，中性ε-Ade呈現(xiàn)兩個(gè)激發(fā)峰，其中236.0 nm處激發(fā)峰變化較為劇烈，可能為中性ε-Ade特征激發(fā)峰。

在HPLC分析過程中，堿性樣品在硅膠基質(zhì)色譜柱上進(jìn)行分離時(shí)易發(fā)生拖尾現(xiàn)象，增強(qiáng)流動(dòng)相的pH可以抑制硅羥基的電離，從而減少該現(xiàn)象的發(fā)生；另外，流動(dòng)相的pH對(duì)易電離物質(zhì)在HPLC分析中的保留也會(huì)產(chǎn)生重要影響。為了提高本方法檢測(cè)靈敏度，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，本實(shí)驗(yàn)選擇具有一定耐堿性的色譜柱InertSustainTMC18進(jìn)行測(cè)定，其pH耐受范圍為1.0～10.0，保守起見以下實(shí)驗(yàn)選擇pH 9.0對(duì)分析條件進(jìn)行優(yōu)化，該pH下激發(fā)波長(zhǎng)236.0 nm處的熒光強(qiáng)度稍大于276.0 nm處的，因此優(yōu)選激發(fā)波長(zhǎng)236.0 nm，發(fā)射波長(zhǎng)則選擇405.0 nm。

2.1.3 流動(dòng)相甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)ε-Ade熒光性能的影響

HPLC分離過程中，流動(dòng)相中有機(jī)相的比例不僅會(huì)改變其洗脫強(qiáng)度，還會(huì)對(duì)溶質(zhì)的解離狀態(tài)產(chǎn)生影響，為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)與ε-Ade 熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系進(jìn)行了探索。按1.2.4方法控制流動(dòng)相pH為9.0，調(diào)節(jié)色譜峰流出液甲醇體積分?jǐn)?shù)為0～40.0%，在激發(fā)波長(zhǎng)236.0 nm條件下測(cè)定相應(yīng)熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4所示。

圖4 流動(dòng)相甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)ε-Ade熒光性能的影響

由圖4可見，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的升高，ε-Ade的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，甲醇體積分?jǐn)?shù)為40.0%時(shí)的熒光強(qiáng)度較5.0%時(shí)增強(qiáng)約1倍。可能是因?yàn)榱鲃?dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)升高時(shí)，ε-Ade的解離抑制作用不斷增強(qiáng)，另外，甲醇對(duì)于中性ε-Ade具有一定增溶性，從而使得體系中ε-Ade中性形態(tài)比例增加所致?？紤]到保留時(shí)間過短會(huì)影響方法的準(zhǔn)確度與抗干擾能力，在權(quán)衡檢測(cè)靈敏度與保留時(shí)間的基礎(chǔ)上，最終確定流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為20.0%，該條件下ε-Ade保留時(shí)間為12.1 min。

2.1.4 離子強(qiáng)度對(duì)ε-Ade熒光性能的影響

在HPLC分離過程中，流動(dòng)相中無機(jī)鹽的離子強(qiáng)度一定程度上也會(huì)影響樣品的解離狀態(tài)、質(zhì)子化程度，從而對(duì)其色譜峰的對(duì)稱性、保留性能及熒光強(qiáng)度、檢測(cè)靈敏度產(chǎn)生一定程度的影響。為此，本實(shí)驗(yàn)控制流動(dòng)相pH為9.0(1.0 mL 0.1 mol/L Na2CO3+9.0 mL 0.1 mol/L NaHCO3)、甲醇體積分?jǐn)?shù)20%，按1.2.4方法添加適量NaCl使其在色譜峰流出液中的濃度分別為0.00～1.00 mol/L，在激發(fā)波長(zhǎng)236.0 nm條件下測(cè)定相應(yīng)熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可見，增強(qiáng)流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，對(duì)于ε-Ade具有一定的熒光猝滅效應(yīng)，隨著體系中離子強(qiáng)度的增加，熒光強(qiáng)度不斷降低，NaCl濃度為1.00 mol/L時(shí)的熒光強(qiáng)度相比未添加NaCl時(shí)降低約10.33%。通常，對(duì)于易解離的樣品來說，增強(qiáng)溶液的離子強(qiáng)度將會(huì)抑制其解離，使質(zhì)子化程度降低，對(duì)于分子態(tài)發(fā)光樣品而言，熒光強(qiáng)度將有所增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)條件下的結(jié)果似乎與該規(guī)律有所相悖?？赡苁且?yàn)樵趐H 9.0、甲醇體積分?jǐn)?shù)20%的條件下，ε-Ade已基本處于分子態(tài)，熒光性能處于較優(yōu)化狀態(tài)，繼續(xù)增強(qiáng)離子強(qiáng)度時(shí)，鹽析效應(yīng)所帶來的熒光增強(qiáng)作用較小，而分子間距離縮短帶來的碰撞猝滅效應(yīng)反而更明顯；另外，氯離子的重原子效應(yīng)也可能會(huì)產(chǎn)生一定的熒光猝滅作用。因此，為了提高檢測(cè)靈敏度，本實(shí)驗(yàn)條件下不宜在流動(dòng)相中添加額外的無機(jī)鹽來增強(qiáng)離子強(qiáng)度。

圖5 NaCl濃度對(duì)ε-Ade熒光性能的影響

2.2 檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

2.2.1 方法選擇性與抗干擾性

為了評(píng)價(jià)方法檢測(cè)的選擇性以及樣品基質(zhì)中可能存在的干擾物對(duì)該方法準(zhǔn)確度的影響，實(shí)驗(yàn)選擇了甲醛、乙醛以及氧化裂解后可生成的相關(guān)物質(zhì)甘油、乙二醇作對(duì)照，并對(duì)體系本身的一些成分按1.2.5.1方法進(jìn)行處理并檢測(cè)，得到HPLC譜圖，結(jié)果如圖6所示。

注：a.磷酸鹽緩沖液；b.腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液(不加熱)；c.腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液(加熱)；d.純水；e.1.0 μg/mL 甘油；f.1.0 μg/mL 1,2-丙二醇；g.1.0 μg/mL 甲醛；h.1.0 μg/mL 乙醛；i.80.0 ng/mL 3-MCPD；j.200.0 ng/mL 氯乙醛。

由圖6可見：衍生化試劑Ade與衍生化產(chǎn)物ε-Ade 的色譜峰能夠很好地分離，其保留時(shí)間分別為8.50 min和12.10 min；體系本身的成分如磷酸鹽緩沖液、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液(加熱或不加熱)無ε-Ade的色譜峰出現(xiàn)，常見裂解產(chǎn)物甲醛、乙醛雖然質(zhì)量濃度遠(yuǎn)大于3-MCPD，其色譜圖中亦無ε-Ade的色譜峰出現(xiàn)；純水、甘油、1,2-丙二醇經(jīng)氧化裂解處理后進(jìn)行衍生化，其色譜圖中在目標(biāo)峰處呈現(xiàn)極其微弱的小峰，為了探究該峰產(chǎn)生的原因，實(shí)驗(yàn)以質(zhì)譜級(jí)純水為樣品，改變1.2.2方法中高碘酸鈉氧化裂解后的處理程序，發(fā)現(xiàn)不添加還原劑亞硫酸鈉時(shí)該峰比添加之后大很多，而添加亞硫酸鈉處理之后，繼續(xù)添加醋酸鉛處理(添加0.15 mL 275 mmol/L 的醋酸鉛溶液)，將體系中高碘酸、碘酸根沉淀除去可以將該峰抑制至最低。這一現(xiàn)象說明，該處空白峰的出現(xiàn)可能是因?yàn)闅埓娴母叩馑峋哂休^強(qiáng)的氧化性，可以將衍生化試劑Ade氧化產(chǎn)生疏水性與ε-Ade相近的物質(zhì)所致。甘油、1,2-丙二醇在目標(biāo)峰處與純水峰高一致，說明該干擾情況主要來源與水樣一致。綜上所述，衍生化試劑與3-MCPD氧化裂解產(chǎn)物氯乙醛的反應(yīng)選擇性非常高，基于該反應(yīng)的檢測(cè)方法抗干擾性好、靈敏度高。

2.2.2 方法定量性能

按1.2.5.2方法得到純水體系下3-MCPD定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.046x-12.842(y為峰面積；x為3-MCPD的質(zhì)量濃度，ng/mL)，線性回歸系數(shù)(R2)為 0.997，說明線性關(guān)系優(yōu)良。按信噪比3和10可得方法的檢測(cè)限與定量限分別為0.06、0.20 ng/mL。與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的GC-MS/MS方法檢測(cè)限相近，但遠(yuǎn)低于Matthew等[21]的GC-ECD法測(cè)定水樣中3-MCPD的結(jié)果。

取20.0、100.0 ng/mL 3-MCPD樣品2 mL，分別加入50、100、200 μL 800.0 ng/mL 的3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2方法處理后檢測(cè)，得到ε-Ade的實(shí)際峰面積，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的理論值統(tǒng)計(jì)加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，所有樣品的加標(biāo)回收率均在93%以上，平均加標(biāo)回收率為96.12%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.51%～3.48%之間，說明該方法的準(zhǔn)確度與精密度很高。

分別取5.0、20.0、50.0 ng/mL 3-MCPD樣品，按1.2.2方法處理后檢測(cè)，以日內(nèi)5次測(cè)定和連續(xù)5 d測(cè)定的方式對(duì)方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，日內(nèi)測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～4.6%，日間測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～5.6%，說明該方法的穩(wěn)定性好，重復(fù)性高。

2.3 食用油中游離3-MCPD的測(cè)定

2.3.1 食用油中3-MCPD氧化裂解預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化

由于3-MCPD與油脂中各組分的極性相差較大，極易溶于水，所以采用簡(jiǎn)單的液-液萃取方法即可實(shí)現(xiàn)對(duì)其分離預(yù)處理。為了避免萃取中產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，可采用NaCl溶液(0.01 g/mL)作為水相進(jìn)行萃取。但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)增加水相鹽濃度后，出現(xiàn)空白溶液的目標(biāo)干擾峰增大的情況。為此，按1.2.2方法對(duì)0.01 g/mL NaCl溶液的氧化裂解預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行比較優(yōu)化，處理方法參數(shù)設(shè)置見表1，不同處理方法所測(cè)得的對(duì)應(yīng)空白溶液HPLC譜圖如圖7所示。

表1 降低空白峰的3種方法

圖7 3種降低空白峰的方法結(jié)果比較

從圖7可以看出，按c方法進(jìn)行處理時(shí)，在目標(biāo)峰處會(huì)出現(xiàn)相對(duì)較高的背景干擾，這可能是由于離子強(qiáng)度增大時(shí)，亞硫酸鈉對(duì)于高碘酸鈉的還原反應(yīng)會(huì)受到一定程度的抑制，殘留的痕量高碘酸根離子含量增強(qiáng)，使得ε-Ade的干擾產(chǎn)物有所升高所致，如果在亞硫酸鈉處理后，加入醋酸鉛使體系中的氧化性陰離子沉淀脫除后，干擾峰減弱至可忽略不計(jì)的水平，所以對(duì)于油脂樣品中3-MCPD的檢測(cè)，采取了方法a對(duì)液-液萃取后的水相體系進(jìn)行處理，具體操作步驟如1.2.6.3方法中所述。

2.3.2 食用油中3-MCPD定量測(cè)定方法評(píng)價(jià)

采用0.01 g/mL NaCl溶液代替純水作為3-MPCD萃取溶劑后，其定量標(biāo)準(zhǔn)曲線也會(huì)因此有所差異，為此，需要用0.01 g/mL NaCl溶液配制1.0～500.0 ng/mL 的3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.6.3方法進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)行HPLC-FLD測(cè)定，再根據(jù)1.2.5.2 方法繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.33x+2.99 (R2=0.999 9)。按1.2.6.1 方法進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，可得加標(biāo)回收率為90.11%～102.70%，說明該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度與精密度高，可用于食用油中游離3-MCPD的檢測(cè)。

2.3.3 實(shí)際食用油樣品檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)以6種常見植物油樣品為例進(jìn)行了相關(guān)測(cè)定，按1.2.6.2方法對(duì)其液-液萃取，萃取所得下層水相按1.2.6.3方法進(jìn)行預(yù)處理、HPLC-FLD檢測(cè)，6種常見植物油HPLC譜圖如圖8所示。

注：a.玉米油；b.山茶油；c.稻米油；d.大豆油；e.花生油；f.菜籽油。

由圖8可見，采用該方法對(duì)6種常見植物油中游離3-MCPD檢測(cè)時(shí)，譜圖中衍生化產(chǎn)物峰形對(duì)稱，基質(zhì)干擾少，目標(biāo)物檢測(cè)選擇性好。按上述定量標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，玉米油、山茶油、稻米油、大豆油、花生油、菜籽油中3-MCPD的含量分別為6.28、10.53、12.17、17.70、59.99、89.75 μg/kg，3次重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.32%～4.63%。不同油脂3-MCPD含量之間差異較大，這可能與各種油料的理化特性以及精煉工藝處理方式不同有關(guān)。

3 結(jié) 論

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)3-MCPD經(jīng)高碘酸氧化裂解、腺嘌呤衍生化后產(chǎn)物的熒光光譜特點(diǎn)進(jìn)行了深入探討，并對(duì)影響衍生化產(chǎn)物熒光性能的因素進(jìn)行了研究，對(duì)HPLC-FLD檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。另外，在優(yōu)化的檢測(cè)條件下，對(duì)植物油樣品中3-MCPD的檢測(cè)進(jìn)行了應(yīng)用評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：在流動(dòng)相pH 9.0、流動(dòng)相甲醇體積分?jǐn)?shù)20%、流動(dòng)相中不添加額外的鹽離子、激發(fā)波長(zhǎng)236.0 nm、發(fā)射波長(zhǎng)405.0 nm時(shí)，對(duì)于水相體系中3-MCPD具有更高靈敏度(檢測(cè)限與定量限分別為0.06、0.20 ng/mL)；用于植物油中游離3-MCPD測(cè)定時(shí)，以 0.01 g/mL的NaCl溶液作為萃取水相，在3-MCPD 氧化裂解后的高碘酸鈉處理過程中，加入1.1倍的醋酸鉛溶液可以抑制空白峰的干擾。將其應(yīng)用于6種常見食用植物油樣品的測(cè)定，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好(RSD在0.32%～4.63%之間)，樣品譜圖顯示基質(zhì)干擾很小，選擇性高。本方法可為油脂生產(chǎn)企業(yè)與質(zhì)量監(jiān)督部門提供一種3-MCPD測(cè)定的新思路與新方法。