錢森和，鄭 鵬，周 炎，胡劉秀，王 洲，薛正蓮

(1.安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000； 2.蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，安徽 蕪湖 241000)

植酸(Phytic acid)，又名環(huán)己醇六磷酸酯，是一種有機磷酸類化合物，是植物種子中磷的主要來源[1]。植酸廣泛存在于植物的種子、根和莖中，其中以豆科植物的種子、谷物的麩皮和胚芽中含量最高[2]。植酸呈無色或淡黃色，是一種無味稠狀液體，易溶于水、乙醇，不溶于醚等有機溶劑[3]。由于植酸無毒副作用、安全可靠，在食品抗氧化劑、穩(wěn)定劑、護色劑、保鮮劑等方面應用廣泛；在醫(yī)藥工業(yè)中可用于治療糖尿病、腎結(jié)石等病癥；另外，植酸可以作為肌醇生產(chǎn)的重要原料[4]。

芝麻粕是芝麻制油的副產(chǎn)物，我國是芝麻生產(chǎn)大國，芝麻粕產(chǎn)量較大，而芝麻生產(chǎn)企業(yè)大多將芝麻粕作為廉價肥料或基質(zhì)出售，很大程度上降低了芝麻生產(chǎn)的附加值[5-6]。芝麻粕中不僅含有大量的蛋白質(zhì)、木脂素、纖維素和維生素類物質(zhì)，而且還含有豐富的植酸類物質(zhì)，是提取植酸的良好原料[7-8]。目前，芝麻粕中蛋白質(zhì)、活性肽、木脂素的提取及其功能研究較多，而芝麻粕中植酸提取的研究鮮有報道[9-10]。因此，本文以芝麻粕為材料，利用單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化植酸的超聲波輔助提取工藝，并對提取的植酸進行還原力及DPPH自由基、羥自由基清除能力測定，以期為芝麻粕中植酸的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芝麻粕，由水代法制油得到，取自蕪湖市同順和小磨麻油食品廠，其含水量為12.1%、粗灰分含量為12.2%(干基)、粗蛋白質(zhì)含量為37.8%(干基)、粗脂肪含量為4.1(干基)、植酸含量為3.8%(干基)，粉碎后過100目篩。三氯化鐵、三氯乙酸、磺基水楊酸、鐵氰化鉀、DPPH、鄰二氮菲、VC、醋酸，分析純。

TU-1800紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；FC104電子天平，上海精密科學儀器公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市億通電子有限公司；PHSJ-3F酸度計，上海雷磁儀器廠；TGL-16型離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植酸的提取

稱取10 g粉碎過篩的芝麻粕于250 mL具塞三角瓶中，按一定的料液比加入一定質(zhì)量分數(shù)的醋酸溶液，在不同的超聲波功率下超聲處理不同時間，然后在一定提取溫度條件下提取一定時間，隨后3 000 r/min離心10 min，測定提取液中植酸含量。不同處理試驗重復3次，下同。

1.2.2 提取液中植酸含量的測定

取植酸提取液25 mL，調(diào)節(jié)pH至1.8～2.5，在水浴上加熱至60℃，加10滴10%磺基水楊酸溶液，用0.02 mol/L三氯化鐵溶液滴定至紫紅色，按下式計算植酸質(zhì)量。

m=c×V×0.235 7

式中：m為植酸質(zhì)量，g；c為三氯化鐵溶液質(zhì)量濃度，mol/L；V為滴定耗去的三氯化鐵溶液量，mL；0.235 7為換算系數(shù)，由每摩爾植酸可絡(luò)合2.8 mol FeCl3換算得到。

植酸提取率=提取液中植酸質(zhì)量/(芝麻粕質(zhì)量×芝麻粕中植酸含量)×100%。

1.2.3 還原力的測定

取植酸提取液0.5 mL于試管中，加入pH為6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1.0%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，充分混勻后50℃保溫20 min，置于冰浴中冷卻，隨后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混合后3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL和蒸餾水2 mL，混勻后靜置10 min，測定其在700 nm處的吸光值[11]。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定

取1 mL樣品與4 mL 0.02 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合，混勻后在室溫條件下避光放置30 min，混合液于3 000 r/min離心5 min，取上清液，測定517 nm處的吸光值，用體積比1∶1的無水乙醇與水混合液作為參比[12]。

C=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：C為DPPH自由基清除率；A0為空白對照(DPPH-無水乙醇)的吸光值；A1為加入樣品時DPPH(樣品+DPPH-無水乙醇)的吸光值；A2為樣品(樣品+無水乙醇)的吸光值。

1.2.5 羥自由基清除率的測定

取7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液0.2 mL、7.5 mmol/L FeSO4溶液0.2 mL、pH 7.4 PBS溶液2.0 mL、1.0%H2O20.4 mL、樣品溶液0.4 mL、蒸餾水0.8 mL于試管中并充分混勻，置于37℃的恒溫水浴60 min后，測定其在536 nm處的吸光值[13]。

COH=(A2-A0)/(A1-A0)×100%

式中：COH為羥自由基的清除率；A0為蒸餾水代替樣品測得的吸光值；A1為蒸餾水代替H2O2測得的吸光值；A2為加入樣品的吸光值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理和作圖，SAS 9.1統(tǒng)計分析軟件進行響應面設(shè)計及其回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲波功率對植酸提取的影響

在醋酸質(zhì)量分數(shù)10%、料液比1∶10、超聲波時間15 min、提取溫度50℃、提取時間60 min的條件下，考察超聲波功率對植酸提取的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲波功率對芝麻粕植酸提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲波功率的增大，植酸提取率逐漸升高，當超聲波功率為270 W時，植酸提取率達到最大值，繼續(xù)增加超聲波功率，植酸提取率反而下降。超聲波產(chǎn)生的空化作用能夠有效地破壞細胞壁，從而有利于植酸的溶出，因此通過適當功率的超聲波處理芝麻粕可以促進植酸的提取。然而，超聲波功率過大，超聲波的空化作用增強，可能造成植酸的破壞，使得植酸的提取率降低[14]。因此，選擇超聲波功率為270 W較為適宜。

2.1.2 超聲波時間對植酸提取的影響

在醋酸質(zhì)量分數(shù)10%、料液比1∶10、超聲波功率270 W、提取溫度50℃、提取時間60 min條件下，考察超聲波時間對植酸提取的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波時間對芝麻粕植酸提取率的影響

由圖2可知，隨著超聲波時間的延長，植酸提取率逐漸升高，當超聲波時間為20 min時，植酸提取率達最大值，而后隨著超聲波時間的繼續(xù)延長，植酸提取率反而下降。這是由于合適的超聲波時間，能夠有效地破碎細胞壁，使得溶出物增多，植酸提取率升高。而超聲波時間過長，可能會導致細胞壁纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散，從而使植酸進入纖維素結(jié)構(gòu)中而不易溶出[15]。綜上，選擇超聲波功率270 W、超聲波時間20 min進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.1.3 醋酸質(zhì)量分數(shù)對植酸提取的影響

在超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、料液比1∶10、提取溫度50℃、提取時間60 min條件下，考察醋酸質(zhì)量分數(shù)對植酸提取的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，醋酸質(zhì)量分數(shù)對植酸提取影響較大。隨著醋酸質(zhì)量分數(shù)的增大，植酸提取率逐漸增大，當醋酸質(zhì)量分數(shù)為15%時，植酸提取率達最大值。這可能是由于隨著醋酸濃度升高，植酸的絡(luò)合能力逐漸降低，溶出增多。但提取液的醋酸質(zhì)量分數(shù)過高，導致pH升高，使酸性多糖、蛋白質(zhì)等酸溶性成分游離出來，又重新與植酸結(jié)合成螯合狀態(tài)，從而使植酸的溶解度下降。因此，選擇醋酸質(zhì)量分數(shù)為15%較為適宜。

圖3 醋酸質(zhì)量分數(shù)對植酸提取率的影響

2.1.4 料液比對植酸提取的影響

在超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、醋酸質(zhì)量分數(shù)10%、提取溫度50℃、提取時間60 min的條件下，考察料液比對植酸提取的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對植酸提取率的影響

由圖4可知，植酸提取率隨料液比的增加而增加。料液比較小，則芝麻粕不能被完全浸透，不能完全破壞植酸與其他物質(zhì)的結(jié)合，從而影響植酸的提取。若料液比過大，植酸提取率提高，但增加了后續(xù)濃縮工序，使得能耗增加。在料液比高于1∶15后，植酸提取率增加不明顯，因此選擇料液比1∶15較為適宜。

2.1.5 提取溫度對植酸提取的影響

在超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、醋酸質(zhì)量分數(shù)10%、料液比1∶10、提取時間60 min的條件下，考察提取溫度對植酸提取的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知：當提取溫度低于50℃時，植酸提取率隨提取溫度的升高而升高，主要是因為分子動能的增大有利于植酸的提取；當提取溫度高于50℃時，植酸提取率有所下降，可能是由于芝麻粕中蛋白質(zhì)等物質(zhì)的溶出，與具有6個磷酸根獨特結(jié)構(gòu)的植酸結(jié)合而沉淀，使得植酸提取率下降。因此，較適的提取溫度為50℃。

圖5 提取溫度對植酸提取率的影響

2.1.6 提取時間對植酸提取的影響

在超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、醋酸質(zhì)量分數(shù)10%、料液比1∶10、提取溫度50℃的條件下，考察提取時間對植酸提取的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 提取時間對植酸提取率的影響

由圖6可知，在提取時間為15～90 min范圍內(nèi)，植酸提取率隨提取時間的延長而增加，當提取時間長于90 min時，其提取率有所下降。這是由于芝麻粕中的植酸由固相遷移至提取液的過程是一個緩慢達到傳質(zhì)平衡的過程，因而隨著提取時間的延長，提取液中植酸含量增大。然而，在一個長時間低pH和較高反應溫度條件下致使植酸在一定程度上發(fā)生氧化，從而導致提取率有所下降。因此，選擇最適提取時間為90 min。

2.2 響應面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計，對影響植酸提取過程中的醋酸質(zhì)量分數(shù)(X1)、料液比(X2)、提取溫度(X3)和提取時間(X4)4個因素設(shè)計四因素三水平中心組合試驗，響應面試驗設(shè)計及結(jié)果見表1，回歸模型分析見表2。

表1 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

從表2可以看出：響應面模型P<0.05，說明該模型達到顯著水平；醋酸質(zhì)量分數(shù)、提取時間、料液比與提取時間的交互作用對植酸的提取具有顯著影響，醋酸質(zhì)量分數(shù)的二次項、料液比的二次項對植酸的提取具有極顯著影響。提取時間對植酸提取率的影響最大，醋酸質(zhì)量分數(shù)次之，而提取溫度和料液比的影響較小。模型的復相關(guān)系數(shù)(R2)為0.90，說明該回歸方程可以準確地預測不同提取條件對植酸提取率的影響。

通過回歸分析，最優(yōu)點X1、X2、X3、X4對應的代碼分別為0.084 471、0.224 161、0.298 996、0.805 674，其實際值為15.42%、1∶16.12、51.49℃、114.17 min，此時植酸提取率的最大理論擬合值為72.77%。在醋酸質(zhì)量分數(shù)15%、料液比1∶16、提取溫度51℃和提取時間115 min的條件下進行驗證試驗，芝麻粕的植酸提取率為73.24%，與理論擬合值差別不大。

2.3 芝麻粕植酸抗氧化活性

2.3.1 植酸的還原力(見圖7)

圖7 芝麻粕植酸的還原力

由圖7可知，芝麻粕植酸的還原力略低于VC，但仍具有一定的還原力。隨著芝麻粕植酸質(zhì)量濃度的增加，其還原力逐漸增強；當植酸質(zhì)量濃度達到80 μg/mL后，隨著其質(zhì)量濃度的進一步增加，還原力變化不明顯。

2.3.2 植酸的DPPH自由基清除能力(見圖8)

圖8 芝麻粕植酸的DPPH自由基清除能力

由圖8可知，芝麻粕植酸的DPPH自由基清除能力略低于VC，當質(zhì)量濃度為120 μg/mL時，VC的DPPH自由基清除率為89.1%，芝麻粕植酸的 DPPH 自由基清除率為68.2%，說明芝麻粕植酸仍具有一定的DPPH自由基清除能力。另外，隨著芝麻粕植酸質(zhì)量濃度的增加，其DPPH自由基清除率逐漸增加，當植酸質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，DPPH自由基清除率基本達到峰值。

2.3.3 植酸的羥自由基清除能力(見圖9)

圖9 植酸的羥自由基清除能力

由圖9可知，芝麻粕植酸的羥自由基清除能力與VC相當，當質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL之間，其羥自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，當質(zhì)量濃度為120 μg/mL時，植酸和VC的羥自由基清除率分別為69.6%和67.8%。

3 結(jié) 論

采用超聲波輔助醋酸法提取芝麻粕植酸，采用單因素試驗和正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化，并對所提取植酸的抗氧化活性進行了研究。結(jié)果表明，芝麻粕植酸的最佳提取工藝條件為超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、醋酸質(zhì)量分數(shù)15%、料液比1∶16、提取溫度51℃、提取時間115 min，在此條件下芝麻粕植酸提取率為73.24%。芝麻粕植酸具有一定抗氧化活性，其最大還原力、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率的植酸質(zhì)量濃度分別為80、100 μg/mL和120 μg/mL，其中當植酸質(zhì)量濃度為120 μg/mL時，其羥自由基清除率與VC相當。