吳育芝 劉偉仙 林智

(1?？谑械谌嗣襻t(yī)院眼耳鼻咽喉科，海南 海口 571100；2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)是原發(fā)于視網(wǎng)膜的惡性腫瘤，對(duì)患者的視功能造成嚴(yán)重?fù)p害，嚴(yán)重時(shí)可危及生命〔1〕。由于發(fā)病初期，腫瘤體積較小且位于視網(wǎng)膜的周邊，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)，易出現(xiàn)漏診〔2〕。臨床主要采用放療、化療、眼球摘除手術(shù)等方法進(jìn)行治療，雖然治療方法不斷改善，但治療療效依然有限〔3〕。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，可通過(guò)與靶基因互不結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用〔4〕。研究顯示，miR-219-5p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào)，miR-219-5p過(guò)表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，其靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)調(diào)控RTK途徑影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能〔5〕。miR-219-5p在黑素瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著降低，其低表達(dá)的黑素瘤預(yù)后較差，上調(diào)miR-219-5p表達(dá)可能通過(guò)靶向Bcl-2抑制黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并增強(qiáng)其化學(xué)敏感性〔6〕。目前，miR-219-5p在RB中的表達(dá)及對(duì)其增殖、遷移和侵襲的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討miR-219-5p在RB細(xì)胞Y79的表達(dá)情況及其對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑 人正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞系A(chǔ)CBRI-181和人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Y79細(xì)胞，美國(guó)ATCC公司；胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑、PCR試劑盒和LipofectamineTM2000試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TOYOBO公司；引物序列和質(zhì)粒載體，廣州市復(fù)能基因有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒，北京雷根生物技術(shù)有限公司；NEK6、周期蛋白依賴性激酶(CDK)1和細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體，美國(guó)Santa Cruz公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和β-actin抗體，中國(guó)北京BIO-SYNTHESIS公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，F(xiàn)ermentas公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)，美國(guó)Sigma公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Y79細(xì)胞和ACBRI-181細(xì)胞均使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Y79細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(1×105個(gè)/孔)，細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，采用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染miR-con、miR-219a-5p mimics、si-con、si-NEK6及共轉(zhuǎn)染miR-219a-5p mimics與pcDNA、miR-219a-5p mimics與pcDNA-NEK6。轉(zhuǎn)染后12 h，更換新鮮含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3qRT-PCR檢測(cè)miR-219a-5p和NEK6 mRNA表達(dá) 參照Trizol試劑操作說(shuō)明提取細(xì)胞中總RNA，測(cè)定純度和濃度之后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按照PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-219a-5p以U6為內(nèi)參，NEK6以β-actin為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算miR-219a-5p和NEK6 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 加入細(xì)胞裂解液，置于冰上充分裂解30 min提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣本30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜后，加入ECL顯影，曝光拍照。Quantity One軟件分析，以目的蛋白條帶的灰度值和內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后的Y79細(xì)胞，以每孔103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，混合均勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在490 nm處的OD值。

1.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染后的Y79細(xì)胞，用不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×105個(gè)/ml，取100 μl直接加入 Transwell小室的上室，下室加入500 μl含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。取出小室，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，棉簽擦去上室內(nèi)層細(xì)胞，經(jīng)甲醛固定、結(jié)晶紫染色后顯微鏡觀察。隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中Transwell小室的上室預(yù)先鋪基質(zhì)膠，其余與遷移實(shí)驗(yàn)操作相同。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證 Target Scan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NEK6是miR-219a-5p的靶基因。分別構(gòu)建野生型(WT)及突變型(MUT)NEK6 3′UTR的報(bào)告基因pGL3質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法分別將NEK6 3′UTR-WT+miR-219a-5p mimics、NEK6 3′UTR-WT+miR-con、EK6 3′UTR-MUT+miR-219a-5p mimics、NEK6 3′UTR-MUT+miR-con轉(zhuǎn)染至Y79細(xì)胞，48 h后，參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-219a-5p和NEK6在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞Y79與正常人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞ACBRI-181中的表達(dá) 與ACBRI-181細(xì)胞比，Y79細(xì)胞中miR-219a-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，NEK6 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表1。

表1 miR-219a-5p和NEK6在Y79細(xì)胞和ACBRI-181細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 NEK6蛋白表達(dá)

2.2過(guò)表達(dá)miR-219a-5p對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-con組比，miR-219a-5p組Y79細(xì)胞miR-219a-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明miR-219a-5p過(guò)表達(dá)的Y79細(xì)胞構(gòu)建成功。MTT結(jié)果顯示，與miR-con組比，miR-219a-5p組Y79細(xì)胞培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)，細(xì)胞OD值顯著降低(P<0.05)。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-con組比，miR-219a-5p組Y79細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表2。

圖2 Y79細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)(結(jié)晶紫，×100)

表2 抑制miR-219a-5p表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.3miR-219a-5p過(guò)表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與miR-con組比，miR-219a-5p組Y79細(xì)胞CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表3。

圖3 Y79細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 miR-219a-5p過(guò)表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4miR-219a-5p靶向調(diào)控NEK6的表達(dá) Target Scan在線靶基因預(yù)測(cè)工具顯示，NEK6的3′UTR中含有與miR-219a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列(圖4)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-219a-5p+NEK6-WT組熒光素酶活性(0.58±0.08)顯著低于miR-con+NEK6-WT組(1.00±0.11；t=9.264,P=0.000)，而miR-219a-5p+NEK6-MUT組與miR-con+NEK6-MUT組熒光素酶活性(1.16±0.16、0.93±0.09)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明miR-219a-5p靶向調(diào)控NEK6表達(dá)。與miR-con組(0.53±0.06)比，miR-219a-5p組Y79細(xì)胞中NEK6蛋白(0.19±0.03)顯著降低(P<0.05)；而與anti-miR-con組(0.63±0.07)比，anti-miR-219a-5p組(0.81±0.09)顯著升高(P<0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明miR-219a-5p在Y79細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控NEK6表達(dá)。

1～4：miR-con、miR-219a-5p、anti-miR-con、anti-miRV219a-5p圖4 NEK6的3′UTR中含有與miR-219a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.5抑制NEK6表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用 與si-con組比，si-NEK6組Y79細(xì)胞NEK6蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，培養(yǎng)后48 h和72 h細(xì)胞OD值顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)均顯著降低(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5，表4。

圖5 Y79細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 抑制NEK6表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及其相關(guān)蛋白的作用

2.6miR-219a-5p和NEK6表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用 與miR-219a-5p+pcDNA組比，miR-219a-5p+pcDNA-NEK6組Y79細(xì)胞NEK6蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與miR-219a-5p+pcDNA組比，miR-219a-5p+pcDNA-NEK6組Y79細(xì)胞培養(yǎng)48 h和72 h細(xì)胞OD值顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)均顯著升高(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表5,圖6。

表5 miR-219a-5p和NEK6表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及其相關(guān)蛋白的作用

1～4：miR-con組、miR-291a-5p組、miR-291a-5p+pcDNA組、miR-291a-5p+pcDNA-NEK6組圖6 Y79細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

RB是一種常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤，多發(fā)生于兒童時(shí)期，約占兒童惡性腫瘤的3%〔7〕。由于早起診斷的局限性，兒童期腫瘤的死亡率較高〔8〕。多種miRNA在RB中表達(dá)異常，參與RB的發(fā)生和發(fā)展。miR-29a在RB組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)顯著抑制RB細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)RB細(xì)胞凋亡，miR-29a可能通過(guò)抑制STAT3對(duì)RB發(fā)揮腫瘤抑制作用〔9〕。miR-613在RB組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低，miR-613過(guò)表達(dá)抑制RB細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并在體外誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，miR-613通過(guò)下調(diào)E2F5在RB中起腫瘤抑制劑作用〔10〕。

miR-219-5p是一個(gè)與腫瘤高度相關(guān)的miRNA家族成員，目前已被證實(shí)其在非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中異常表達(dá)〔11～13〕，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果提示，miR-219-5p作為腫瘤抑制因子在RB中發(fā)揮作用，可能是RB治療的潛在靶點(diǎn)。細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞周期，Cyclin和CDK是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白〔14〕。細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的基礎(chǔ)。MMP是一類能降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的酶類，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲〔15〕。本研究結(jié)果提示，miR-219-5p能調(diào)控與Y79細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)。

miRNA在腫瘤疾病中通過(guò)調(diào)控其下游靶基因表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用〔16〕。Target Scan等靶基因在線預(yù)測(cè)工具顯示，miR-219a-5p可與NEK6的3′UTR中核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合，猜測(cè)miR-219a-5p可靶向調(diào)控NEK6表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了Y79細(xì)胞中miR-219a-5p靶向調(diào)控NEK6的表達(dá)。本研究結(jié)果說(shuō)明miR-219a-5p靶向負(fù)調(diào)控NEK6表達(dá)。NEK6參與調(diào)控細(xì)胞周期〔17〕，研究顯示，NEK6在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，與患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等密切相關(guān)，下調(diào)NEK6表達(dá)可有效降低胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力〔18〕。本研究結(jié)果與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致〔19〕，提示NEK6作為促腫瘤因子在RB中起重要作用，抑制其表達(dá)有助于RB的治療。研究還發(fā)現(xiàn)，NEK6過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-219a-5p過(guò)表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，進(jìn)一步說(shuō)明miR-219a-5p通過(guò)調(diào)控NEK6表達(dá)在RB中發(fā)揮腫瘤抑制作用。