王燕 石劍 貢麗雅 王鳳姣

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院營養(yǎng)科，河北 石家莊 050000)

腦梗死具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率的特點，是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一〔1〕，近年來，其發(fā)病率不斷提高，且呈現(xiàn)出明顯的年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅人類身心健康〔2〕。腦梗死患者神經(jīng)功能受損嚴(yán)重，常因意識不清而不能自主進(jìn)食，引起不同程度的營養(yǎng)不良及免疫功能低下，還經(jīng)常伴隨腸道菌群失調(diào)、胃腸功能紊亂、腸黏膜屏障受損等并發(fā)癥，影響其預(yù)后〔3〕。“腦-腸軸”是腸道菌群與大腦之間的雙向通信系統(tǒng)，腦梗死患者即可通過腦-腸軸之間的神經(jīng)、激素和免疫信號而影響腸道菌群的組成及代謝，進(jìn)而影響胃腸功能造成各種并發(fā)癥〔4〕，而腸道菌群與大腦之間是雙向的調(diào)節(jié)關(guān)系〔5〕，因此通過影響腸功能修復(fù)腦梗死患者腦損傷是臨床研究的熱點。研究表明，腦梗死患者進(jìn)行早期腸內(nèi)營養(yǎng)支持，可維持患者營養(yǎng)支持，改善患者腸道功能紊亂和便秘癥狀，促進(jìn)腸黏膜免疫系統(tǒng)細(xì)胞代謝和組織功能恢復(fù)，提高機(jī)體免疫功能，改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高抗感染能力，進(jìn)而減輕腦損傷，改善神經(jīng)功能缺損癥狀〔6,7〕；益生菌主要是常見的乳酸桿菌及雙歧桿菌，屬于人體腸道正常菌群的優(yōu)勢菌，應(yīng)用益生菌治療可以抑制條件致病菌過度生長，有效維持腸道菌群平衡，并保護(hù)腸黏膜屏障〔8〕，并可有效提高機(jī)體免疫力〔9〕。但益生菌聯(lián)合腸內(nèi)營養(yǎng)對腦梗死大鼠腸黏膜屏障、免疫及認(rèn)知功能的影響目前還不清楚，本文通過建立腦缺血再灌注大鼠模型，對其進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1動物 SD雄性大鼠〔許可證號：SCXK(粵)2013-0034，廣東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心〕，SPF清潔級，體重200～240 g，在清潔安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)，自然光照，溫度保持在約25℃，濕度約為50%，噪音不高于80 dB，每小時保持通風(fēng)換氣約10次，定期清理鼠籠，消毒，更換墊料、飼料、飲水。

1.2主要試劑及儀器 雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(蒙古雙奇藥業(yè)公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字為 S19980004)；腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液〔紐迪希亞制藥(無錫)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字為H20030011〕；脂肪乳氨基酸(17)葡萄糖(11%)注射液(Fresenius Kabi AB生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字為J20040090)；DAO檢測試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司生產(chǎn)，貨號為JK-(a)-2773)；D-乳酸檢測試劑盒〔孟成科技(上海)有限公司生產(chǎn)，貨號為K667〕；大鼠CD4+-PE(上海恒斐生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號為201507-1)；大鼠CD8+-FITC(武漢博歐特生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號為orb248785)；大鼠IgG ELISA試劑盒(美國Abcam公司生產(chǎn)，貨號為ab189578)；大鼠IgM酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Abcam公司生產(chǎn)，貨號為ab215085)等。XR-XC105型Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)；Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf股份公司)；制冰機(jī)、恒溫水浴鍋(北京六一儀器廠)等。

1.3動物模型制備及分組給藥 參考文獻(xiàn)〔10〕，將SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 ml/kg)麻醉，以仰臥位固定在鼠板上，頸部備皮后以75%酒精消毒，在正中做約2 cm的縱向切口，分離暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)，在血管外預(yù)置縫線備用，沿CCA 向上繼續(xù)分離暴露頸外動脈(ECA)，以縫線結(jié)扎CCA及ECA近心端，以動脈夾夾閉CCA 遠(yuǎn)心端，在距CCA分叉部4 mm處剪一小口，插入0.24 mm的線栓后用縫線打一活結(jié)，取下動脈夾，稍提ECA繼續(xù)緩慢插入線栓至感覺到阻力阻塞血管，扎緊CCA遠(yuǎn)心端的縫線，拴線尾端部分暴露于外，1.5 h后將栓線抽出，即完成缺血模型制備，根據(jù)大鼠活動情況，以Longa分級法〔11〕對造模后大鼠的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評分，標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)功能缺損0分、不能完全伸展對側(cè)前爪1分、行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈2分、行走向?qū)?cè)傾倒3分、意識喪失，不能自發(fā)行走4分、死亡5分。評分1～3分為成功的大鼠模型〔12〕，共成功48只，將其隨機(jī)分為模型組、益生菌組、腸內(nèi)營養(yǎng)組、益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組，每組12只。另取12只大鼠僅麻醉后只暴露、分離CCA、ECA后縫合處理，作為假手術(shù)組。

各組大鼠均做空腸置管造瘺術(shù)：在幽門處插入直徑約1.0 mm的無菌硅膠管，遠(yuǎn)端到達(dá)屈氏韌帶以下5 cm處固定，由皮下隧道至頸背部肩胛間引出，各組大鼠均在首次用藥前以微量輸液泵推注2 ml生理鹽水沖洗腸管。參照文獻(xiàn)進(jìn)行人鼠劑量換算，雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片，研磨后加入20 ml水中，以微量輸液泵經(jīng)腸管注入大鼠體內(nèi)，每天300 mg/kg〔13〕，腸內(nèi)營養(yǎng)液每天以微量輸液泵經(jīng)腸管注入大鼠體內(nèi)35 ml，使總熱量為35 kCal，每次推注5 ml，每天推注7次，兩次推注的時間間隔為2 h〔14〕，假手術(shù)組、模型組、益生菌組每天以微量輸液泵經(jīng)腸管注入脂肪乳氨基酸(17%)葡萄糖(11%)注射液48 ml，使總熱量保持為35 kCal，持續(xù)治療14 d。

1.4標(biāo)本收集及大鼠腸黏膜屏障檢測 各組大鼠經(jīng)尾靜脈取血5 ml，取出1 ml備用，其余4 ml靜置15 min，3 000 r/min，4℃離心15 min，取上清即血清備用。二胺氧化酶(DAO)是小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，其活性與黏膜細(xì)胞的核酸和蛋白合成密切相關(guān)，可反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度，D-乳酸是腸道內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的，當(dāng)腸黏膜受損時，會進(jìn)入血液，可及時反映腸黏膜受損程度和通透性，故檢測血清中DAO、D-乳酸水平，可反映腸黏膜屏障完整性及功能〔15〕。

取收集的血清500 μl分別用DAO、D-乳酸檢測試劑盒檢測血清中DAO、D-乳酸水平，操作步驟參照說明書進(jìn)行。

1.5大鼠免疫功能檢測1.4中的血清500 μl分別用ELISA試劑盒檢測血清中IgG、IgM含量，操作步驟參照說明書進(jìn)行。1.4中的血液以紅細(xì)胞裂解液在冰浴下裂解30 min，1 000 r/min，4℃離心5 min，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞沉淀后計數(shù)，取約含有1×106個細(xì)胞的細(xì)胞液，加入大鼠PE-anti-mCD4、FITC-anti-mCD8單克隆抗體后振蕩混勻，4℃，避光孵育40 min，1 000 r/min，4℃離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞沉淀，加入0.5 ml PBS重懸后混勻，采用流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+百分比，并計算其比值。

1.6大鼠神經(jīng)功能缺損情況檢測 大鼠末次給藥結(jié)束24 h后，觀察各組大鼠活動情況，以Longa分級法〔11〕對其神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評分。

1.7大鼠認(rèn)知功能檢測 大鼠末次給藥結(jié)束24 h后，以Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠認(rèn)知功能，參照文獻(xiàn)〔16〕：準(zhǔn)備一個Morris直徑160 cm、高 50 cm的水迷宮水池，將其分為4個象限，并在每個象限水池壁的正中分別固定4個不同形狀的標(biāo)記作為參照物，向水池中注水，水溫保持22～26℃，水深22 cm，在第三象限正中放置直徑12 cm，高20 cm的平臺。在實驗開始前1 d將大鼠放入水池中進(jìn)行適應(yīng)訓(xùn)練，實驗共進(jìn)行6 d，前5 d為定位航行實驗，將大鼠面朝池壁的標(biāo)記從第一至第四象限放入水中，記錄大鼠找到水下平臺的時間，即為平均逃避潛伏期；第6天為空間探索實驗，撤去平臺，將大鼠面朝池壁的標(biāo)記從第一象限放入水中，記錄其在1 min內(nèi)穿越平臺原位置的次數(shù)，以用來評估大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行方差分析，t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組腸黏膜屏障功能比較

2.1.1各組血漿中DAO、D-乳酸水平比較 與假手術(shù)相比，模型組DAO、D-乳酸的水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，益生菌組、腸內(nèi)營養(yǎng)組、益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組DAO、D-乳酸的水平均明顯降低(P<0.05)；與益生菌組、腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組DAO、D-乳酸的水平均明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組血漿中DAO、D-乳酸水平比較

2.2各組免疫功能比較

2.2.1各組血清中IgG、IgM含量比較 與假手術(shù)組相比，模型組IgG、IgM含量均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，益生菌組、腸內(nèi)營養(yǎng)組、益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組IgG、IgM含量均明顯升高(P<0.05)；與益生菌組、腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組IgG、IgM含量均明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組血清中IgG、IgM含量比較

2.2.2各組血清中T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比較 與假手術(shù)組(2.15±0.25)相比，模型組CD4+/CD8+明顯降低(1.48±0.16，P<0.05)；與模型組相比，益生菌組(1.77±0.19)、腸內(nèi)營養(yǎng)組(1.79±0.20)、益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組(2.05±0.24)CD4+/CD8+均明顯升高(P<0.05)；與益生菌組、腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組CD4+/CD8+均明顯升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組血清中T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+比例

2.3各組認(rèn)知功能比較

2.3.1各組神經(jīng)功能缺損評分比較 與假手術(shù)組〔(0.00±0.000)分〕相比，模型組神經(jīng)功能缺損評分明顯升高〔(2.81±0.27)分，P<0.05〕；與模型組相比，益生菌組〔(1.96±0.19)分〕、腸內(nèi)營養(yǎng)組〔(1.93±0.26)分〕、益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組〔(0.98±0.16)分〕神經(jīng)功能缺損評分均明顯降低(均P<0.05)；與益生菌組、腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組神經(jīng)功能缺損評分均明顯降低(P<0.05)。

2.3.2各組水迷宮實驗結(jié)果比較 與假手術(shù)組(6.80±1.20)相比，模型組水迷宮實驗從第3天起平均逃避潛伏期明顯升高(P<0.05)，穿越原平臺位置次數(shù)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，益生菌組、腸內(nèi)營養(yǎng)組、益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組水迷宮實驗從第3天起平均逃避潛伏期明顯降低(P<0.05)，穿越原平臺位置次數(shù)升高(P<0.05)；與益生菌組、腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，益生菌+腸內(nèi)營養(yǎng)組大鼠水迷宮實驗從第3天起平均逃避潛伏期明顯降低(P<0.05)，穿越原平臺位置次數(shù)明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組平均逃避潛伏期、大鼠穿越原始位置次數(shù)比較

3 討 論

腦-腸軸是腦和腸道之間由神經(jīng)、激素和免疫信號組成并相互影響的通信系統(tǒng)，通過該通信系統(tǒng)，機(jī)體大腦和腸道之間可相互影響，即神經(jīng)系統(tǒng)可通過腦-腸軸影響腸道微生物的組成及數(shù)量，介導(dǎo)腸道免疫及吸收功能；腸道微生物群及其代謝物也可通過腦-腸軸調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能，影響神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)病進(jìn)程，因為腸道微生物在其中起到關(guān)鍵作用，故又稱為微生物-腦-腸軸〔17〕。腦梗死會影響患者腸道菌群組成，使致病菌增多，有益菌下降，損傷腸黏膜屏障，腸內(nèi)營養(yǎng)治療可糾正腸道菌群組成，修復(fù)腸黏膜結(jié)構(gòu)，提高免疫功能〔18〕。益生菌是胃腸道的共生菌，可恢復(fù)腸道菌群正常組成，修復(fù)腸道屏障功能，并通過調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞免疫反應(yīng)提供機(jī)體免疫力〔19〕。對重度顱腦損傷患者的治療中，益生菌聯(lián)合腸內(nèi)營養(yǎng)可有效調(diào)整腸道菌群，改善患者的營養(yǎng)狀況，降低菌群失調(diào)、肺部感染和腹瀉的發(fā)生率〔20〕，根據(jù)“腦-腸軸”學(xué)說，益生菌聯(lián)合腸內(nèi)營養(yǎng)預(yù)計可提高腦梗死患者免疫力，修復(fù)腸黏膜屏障，提高患者認(rèn)知功能。本研究結(jié)果表明腦梗死大鼠腸黏膜屏障明顯受損，免疫力降低，神經(jīng)功能受損，認(rèn)知能力下降。揭示腦梗死大鼠會因腦損傷引起腸腸黏膜屏障及免疫功能受損，和“腦-腸軸”學(xué)說理論相符。本研究結(jié)果表明益生菌、腸內(nèi)營養(yǎng)治療均可修復(fù)大鼠腸黏膜屏障，恢復(fù)受損神經(jīng)功能，提高免疫力及認(rèn)知能力，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，比單獨應(yīng)用效果好，揭示益生菌聯(lián)合腸內(nèi)營養(yǎng)對治療腦梗死具有良好的效果，為腦卒中的臨床治療提供了新的思路。