白牧鑫 韓林露 徐梅昌 楊蕾 鄧旭 王俊 劉善軍

(1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 南京 210014；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病微血管病變最嚴(yán)重的一種并發(fā)癥，是造成慢性腎臟疾病和終末期腎病(ESRD)的重要原因〔1〕。DN是導(dǎo)致我國糖尿病患者死亡的主要原因〔2〕。DN的具體發(fā)病機(jī)制目前還不清楚，但環(huán)境和遺傳因素在其發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。研究顯示，男性患者較女性患者更易出現(xiàn)DN,并發(fā)展到ESRD〔3〕。然而，在DN引起的ESRD中,絕經(jīng)后女性患者的比例顯著升高〔4〕。研究表明，雌激素與DN的發(fā)病機(jī)制有關(guān)〔5〕。雌激素的作用主要受兩種已知的雌激素受體(ESR)——ESRα(ESR1)和ESRβ(ESR2)調(diào)控〔6〕，而ESR1介導(dǎo)大部分的生物學(xué)效應(yīng)〔7〕。雌激素可以通過ESR1上調(diào)內(nèi)皮一氧化氮合酶mRNA的表達(dá)，增加其蛋白質(zhì)表達(dá)水平，加速一氧化氮(NO)的釋放，從而改善NO引起的腎臟損傷〔8〕。研究表明，ESR1基因位點(diǎn)PvuⅡ(rs2234693，C>T)和XbaⅠ(rs9340799，A>G)的多態(tài)性與2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)〔9〕，而目前還沒有關(guān)于ESR1基因多態(tài)性與DN相關(guān)性的報(bào)道。中醫(yī)證型是指在疾病的進(jìn)展過程中，患者個體于某個階段及當(dāng)時所處特定內(nèi)環(huán)境的本質(zhì)反映〔10〕。探討DN的中醫(yī)證型與基因多態(tài)性的相關(guān)性，有利于探究DN的發(fā)病機(jī)制的和進(jìn)一步提高DN的中醫(yī)辨證論治水平。因此，本研究擬探討絕經(jīng)后女性DN患者中醫(yī)證型與ESR1基因多態(tài)性及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對象 選擇2014年1月至2018年12月在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院和濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的148例絕經(jīng)后女性2型DN患者為DN組，平均年齡(58.39±7.42)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)符合我國T2DM防治指南(2007年版)中DN的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)符合DN的中醫(yī)診斷和辨證分型標(biāo)準(zhǔn)；(3)年齡18～70歲；(4)未進(jìn)行腎透析。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)嚴(yán)重心血管、肝臟疾病或合并其他嚴(yán)重原發(fā)性疾病的患者；(2)合并感染或發(fā)熱患者。參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》，結(jié)合DN患者的癥狀體征及舌象脈象，進(jìn)行中醫(yī)辨證分型，分為陰虛熱盛證、氣陰兩虛證和陰陽兩虛證。此外，納入120例絕經(jīng)后女性健康體檢者為對照組，平均年齡(60.24±6.36)歲。參與者均簽署知情同意書。

1.2觀察指標(biāo)及方法

1.2.1一般人口學(xué)特征 記錄所有研究對象的年齡及絕經(jīng)時年齡。

1.2.2實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo) 采集DN患者空腹靜脈血3 ml，以3 600 r/min離心5 min后，分離血清，保存于-20℃條件下。應(yīng)用全自動生化儀(日本奧林巴斯)檢測血清肌酐(Scr)、血清胱抑素(Cys)C、尿酸(UA)。使用高效液相自動測定儀(美國伯樂公司)測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。留取晨尿，采用肌酐酶法測定尿肌酐(U-Cr)，采用散射比濁法測定尿微量白蛋白(m-Alb)。計(jì)算m-Alb與U-Cr的比值(ACR)。

1.3外周血DNA的提取及基因型檢測 抽取兩組患者靜脈血2 ml,乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝，按照QIAGENFlexiGene DNA試劑盒操作步驟提取DNA，采用Nanodrop2000測定DNA濃度，-20℃保存。根據(jù)ESR1基因的兩個 SNP 位點(diǎn)：PvuⅡ(rs2234693,C>T)和 XbaⅠ(rs9340799,A>G)，結(jié)合引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)兩個SNP位點(diǎn)的上下游引物分別為：PvuⅡ(rs2234693,C>T)上游引物為5′-ACATGTTCTGTTGTCCATC-3′，下游引物為5′-CCAACTCTAGACCACACTCAGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度102 bp，XbaⅠ(rs9340799,A>G)的上游引物為5′-CATCTGAGTTCCAAATGTCCC-3′，下游引物為5′-TTTCAGAACCATTAGAGACCAATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度107 bp。反應(yīng)采用三步法聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，優(yōu)化后的反應(yīng)體系條件是：95℃預(yù)變性2 min，1個循環(huán)；95℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Hardy-Weinberg平衡定律(HWE)檢驗(yàn)、方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1基因分布情況 對照組的PvuⅡ和XbaⅠ位點(diǎn)的基因型分布均遵循Hardy-Weinberg平衡法則(PHWE>0.05)?；蚍中徒Y(jié)果表明，DN組和對照組的PvuⅡ位點(diǎn)的基因型和等位基因分布均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；對于XbaⅠ位點(diǎn)，基因型在兩組的分布無顯著差異(P>0.05)，而等位基因的分布兩組間差異顯著(P<0.05)，見表1。

表1 ESR1基因PvuⅡ(rs2234693)和XbaⅠ(rs9340799)的基因型及等位基因分布〔n(%)〕

2.2不同中醫(yī)證型的DN患者ESR1基因型及等位基因分布情況 中醫(yī)辨證分型結(jié)果顯示，陰虛熱盛證39例(26.4%)，氣陰兩虛證64例(43.2%)，陰陽兩虛證45例(30.4%)。對于ESR1基因PvuⅡ位點(diǎn)，3種不同證型的DN患者的基因型及等位基因分布均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。陰虛熱盛證和氣陰兩虛證患者的基因型分布頻率均為CT>CC>TT；陰陽兩虛證患者的基因型分布頻率為TT>CT>CC。PvuⅡ位點(diǎn)野生型等位基因T在3種證型中的分布頻率為陰陽兩虛證>陰虛熱盛證>氣陰兩虛證，見表2。對于XbaⅠ位點(diǎn)，不同證型的DN患者基因型及等位基因分布的差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陰虛熱盛證和陰陽兩虛證患者的基因型分布頻率均為AA>AG>GG；氣陰兩虛證患者的基因型分布頻率為AG>AA>GG。XbaⅠ位點(diǎn)野生型等位基因G在3種證型中的分布頻率為氣陰兩虛證>陰虛熱盛證>陰陽兩虛證，見表3。

表2 不同中醫(yī)證型DN患者ESR1基因PvuⅡ(rs2234693)基因型及等位基因分布〔n(%)〕

表3 不同中醫(yī)證型DN患者ESR1基因XbaⅠ(rs9340799)基因型及等位基因分布〔n(%)〕

2.3不同中醫(yī)證型DN患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) HbA1c在3種證型之間無顯著性差異(P>0.05)；而Scr、CysC、尿ACR及UA在3種證型的患者中兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且隨陰虛熱盛、氣陰兩虛及陰陽兩虛呈現(xiàn)顯著升高趨勢。見表4。

表4 不同中醫(yī)證型DN患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

2.4不同中醫(yī)證型DN患者ESR1基因型和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性 對于ESR1基因的PvuⅡ位點(diǎn)，在陰虛熱盛證和氣陰兩虛證中，相比于攜帶野生型CC者，T等位基因(CT+TT)攜帶者的ACR水平顯著增高(P<0.05),而其他指標(biāo)在不同基因型中差異無顯著性(P>0.05)；在陰陽兩虛證中，T等位基因(CT+TT)患者Scr、CysC、ACR和UA水平都顯著高于CC基因型患者(P<0.05)，見表5。對于ESR1基因的XbaⅠ位點(diǎn),在陰虛熱盛證中，攜帶野生型AA者和G等位基因(AG和GG)者相比，所有實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；在氣陰兩虛證中，攜帶AG和GG基因型者CysC顯著高于AA基因型患者(P<0.05)，而兩組其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；在陰陽兩虛證中，攜帶G等位基因者與AA基因型相比，Scr顯著增高(P<0.05)，而其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與基因型無關(guān)(P>0.05)，見表6。

表5 不同中醫(yī)證型DN患者的Pvu Ⅱ基因型與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析(x)

表6 不同中醫(yī)證型DN患者的XbaⅠ基因型與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討 論

很多學(xué)者認(rèn)為，DN基本按照陰虛熱盛——?dú)怅巸商摗庩杻商摰囊?guī)律動態(tài)演變〔11,12〕。其中氣陰兩虛階段持續(xù)時間較長，是并發(fā)癥加重的病理基礎(chǔ),是影響疾病轉(zhuǎn)歸的樞機(jī)和防治的關(guān)鍵〔13〕。本研究與之前的研究一致〔14〕，說明氣陰兩虛證可能是DN的主要病機(jī)。

ESR是一種蛋白質(zhì)分子，在靶細(xì)胞內(nèi)可以與雌激素特異性結(jié)合形成激素-受體復(fù)合物，使雌激素發(fā)揮復(fù)雜的生物學(xué)作用。ESR包括ESR1和ESR2，而雌激素發(fā)揮的大部分效應(yīng)由ESR1介導(dǎo)，雌激素水平升高對DN具有保護(hù)作用。雌激素與ESR1結(jié)合可以降低血管緊張素2和內(nèi)皮素的合成，從而抑制腎臟血管收縮及降低腎臟的炎癥反應(yīng)〔15〕。此外，雌激素可以通過激活MAPK/AP-2信號通路促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2的表達(dá)和刺激MMP-9的合成，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞纖維化水平，改善DN〔16〕。人類的ESR1基因位于染色體6q24～27區(qū)帶，長度為140 kb，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，而第1內(nèi)含子中的PvuⅡ(rs2234693)和XbaⅠ(rs9340799)是ESR1基因研究最廣泛的兩個位點(diǎn)〔6〕。研究已經(jīng)證實(shí)PvuⅡ和XbaⅠ位點(diǎn)多態(tài)性可以影響ESR1的mRNA表達(dá)，從而引起蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變〔17,18〕。一項(xiàng)meta分析〔9〕結(jié)果顯示，ESR1基因的PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性與T2DM的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，PvuⅡ的等位基因C是中國人群T2DM的保護(hù)因素，而XbaⅠ的G等位基因能夠降低高加索人群T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此，進(jìn)行ESR1基因的這兩個SNP位點(diǎn)與DN的相關(guān)性研究是很有價(jià)值的。

本研究顯示，等位基因T增加了DN的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但XbaⅠ的等位基因G是DN發(fā)病的危險(xiǎn)因素。這說明ESR1基因位點(diǎn)PvuⅡ和XbaⅠ的突變可能會改變ESR1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而通過調(diào)控雌激素的效應(yīng)而參與到DN的發(fā)病機(jī)制中，但具體的發(fā)病機(jī)制還需進(jìn)一步探究。本研究說明攜帶TT、AA基因型基因型的患者更容易發(fā)生嚴(yán)重的腎臟損害。所以本研究確定了絕經(jīng)后女性DN中醫(yī)證型與ESR1基因PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性的聯(lián)系，但是否可以根據(jù)ESR1基因多態(tài)性確定DN的中醫(yī)辨證分型，不同的ESR1基因表型對DN中醫(yī)辨證診治是否具有參考價(jià)值及中醫(yī)治療是否會影響到DN患者ESR1基因的表達(dá)等還需研究。

研究表明HbA1C在DN患者中按按陰虛燥熱、氣陰兩虛、陰陽兩虛呈現(xiàn)遞減趨勢〔1〕，然而本研究卻發(fā)現(xiàn)HbA1C在3種證型的患者中差異無顯著性，可能是由于本研究納入的患者無論是哪種證型，對血糖都有所控制。Scr、CysC和UA是評價(jià)腎功能的重要指標(biāo)。ACR是評價(jià)腎小球早期損傷的敏感指標(biāo)，與腎臟病變嚴(yán)重程度關(guān)系密切。本研究說明，隨著疾病的進(jìn)展，DN患者的腎功能受損逐漸加重，與張茹等〔1〕的研究結(jié)果一致。本研究說明攜帶T等位基因的陰陽兩虛證患者較僅攜帶C等位基因的患者腎功能損傷程度更為嚴(yán)重。這些結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與不同的DN中醫(yī)證型有相關(guān)性，且ESR1基因的PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性也與不同證型患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。觀察實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及ESR1基因多態(tài)性可能對確定DN患者的中醫(yī)證型有一定的指導(dǎo)意義。DN是一種由多因素導(dǎo)致的病因復(fù)雜的疾病，其證型分布受到地域、環(huán)境等影響，DN的易感基因較多而且目前尚未完全闡明，因此，在探討基因多態(tài)性與DN中醫(yī)證型的相關(guān)性時仍需進(jìn)行更加深入的研究。