（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院河南省天然色素制備重點實驗室，河南鄭州450001）

類胡蘿卜素是植物和微生物產(chǎn)生的一類重要的天然脂溶性色素，呈黃色、橙色或紅色[1]。類胡蘿卜素通常分為兩類：胡蘿卜素類（含碳和氫分子），如β-胡蘿卜素和番茄紅素；葉黃素類（含碳、氫和氧分子），如葉黃素和玉米黃素[2]。β-胡蘿卜素是一種具有高疏水性的萜類分子，具有抗氧化活性和維生素A原的特性，是當(dāng)前研究最多的類胡蘿卜素之一，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料和化妝品領(lǐng)域[3-6]。

目前，常見的β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、天然植物提取法和微生物發(fā)酵法3種?；瘜W(xué)合成法往往會導(dǎo)致有害物質(zhì)殘留，在實際應(yīng)用中受到限制[7]；天然植物提取法由于胡蘿卜生產(chǎn)易受到地理、氣候、時間和空間的限制，無法大規(guī)模生產(chǎn)使用，使得β-胡蘿卜素的提取受到影響[8]；微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素由于不受環(huán)境條件的限制，加之產(chǎn)品具有經(jīng)濟、安全等優(yōu)勢，因此該技術(shù)受到國內(nèi)外市場的廣泛青睞[9]。

常見的用于發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素的菌種有紅酵母、紅細菌以及絲狀真菌等。其中，三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora，B.trispora）是目前研究最多的 β-胡蘿卜素生產(chǎn)菌種，合成機理為利用正負菌種混合培養(yǎng)，產(chǎn)生大量性激素類物質(zhì)——三孢酸，進而轉(zhuǎn)化合成β-胡蘿卜素[10]。三孢布拉氏霉菌發(fā)酵法是目前國內(nèi)外大規(guī)模生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的最佳方法，它具有生長迅速、生物量大、單位菌體產(chǎn)量高等明顯優(yōu)勢。本研究以B.trispora為發(fā)酵菌種，通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，以期為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌種

三孢布拉霉菌cgmcc 3.7815，交配型“+”和三孢布拉霉菌 cgmcc 3.7819，交配型“-”：兩菌株（以菌絲保藏）均來自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖（C6H12O6·H2O，分析純）、硫酸鎂（MgSO4·7H2O，分析純）、丙酮（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；玉米漿粉（試劑級）：北京索萊寶有限公司；維生素B1（VB1，生化試劑）：天津市光復(fù)精細化工研究所；磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純）、氨水（分析純）：洛陽市化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

活化培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，115℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：黃豆粉（黃豆直接磨粉）50 g/L、玉米粉 25 g/L、0.05 g/L、用鹽酸和氨水調(diào)pH 6.4～6.7，115℃滅菌30 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉20 g/L、葡萄糖4.8 g/L、黃豆粉 30 g/L、玉米漿粉 2.6 g/L、MgSO40.5 g/L、KH2PO42 g/L，pH自然，115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計（EL20-K）：美國梅特勒托利多公司；電子分析天平（FA2004N）：上海菁海儀器有限公司；立式高壓蒸汽滅菌器（LDZX-75KBS）：上海申安醫(yī)療器械廠；生化培養(yǎng)箱（LRH-250）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器（SHZ-2A）：金壇華峰儀器有限公司；離心機（TDZ7-WS）：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1600B）：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 B.trispora產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化

菌種活化：取上一代保藏于斜面培養(yǎng)基中的菌種菌絲，劃線接種于新的活化培養(yǎng)基中，置于28℃下倒置培養(yǎng)5 d。種子培養(yǎng)：挑取活化培養(yǎng)基上的菌絲接種于裝液量為35 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)期。發(fā)酵培養(yǎng)：將部分種子液接種于裝液量為35 mL/250 mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察負正菌種體積比（0∶0、1 ∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2 ∶1）、發(fā)酵時間（96、108、120、132、144 h）、接種量（5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%）、初始 pH 值（6.00、6.25、6.50、6.75、7.00、7.25）、植物油（金龍魚食用調(diào)和油）添加量（0%、1%、2%、3%、4%）、VB1添加量（0.000%、0.001%、0.002%、0.003%）對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響。根據(jù)β-胡蘿卜素產(chǎn)量篩選影響顯著的因子和水平，采用Box-Behnken設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

1.3.2 測定方法

β-胡蘿卜素產(chǎn)量的測定：參考楊文等[11]的方法，在干菌體中加入5 mL 25%的鹽酸，在28℃，200 r/min條件下恒溫振蕩提取1 h，沉淀物水洗后用10 mL丙酮振蕩提取，提取液在456 nm下測定吸光度。

發(fā)酵生物量的測定：發(fā)酵液在4 000 r/min離心15 min，沉淀物水洗3次后，在105℃的條件下烘干并稱重。生物量單位以g/L表示。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用MS Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；Origin 2018進行單因素方差分析；Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 負正菌接種體積比對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響

不同的負正菌接種體積比可能對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量產(chǎn)生不同的影響。負正菌種在混合培養(yǎng)的過程中，兩菌株互相接觸，生成接合孢子，產(chǎn)生三孢酸，能夠刺激B.trispora從而促進β-胡蘿卜素的大量合成[12-13]。負正菌接種體積比對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響見圖1。

圖1 負正菌接種體積比對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響Fig.1 Effects of negative and positive inoculation volume ratio on β-carotene yield and fermentation biomass

根據(jù)圖1可知，當(dāng)負正菌種體積比為3∶2時，β-胡蘿卜素發(fā)酵產(chǎn)量最高，達到516 mg/L。接種比例過高過低都不利于B.trispora對β-胡蘿卜素的合成。發(fā)酵生物量的趨勢跟產(chǎn)量比較類似，在接種體積比為3∶2時最大。無論是產(chǎn)量還是生物量，數(shù)值最大時負菌數(shù)量多于正菌，這說明負菌產(chǎn)色素能力較正菌強[14-15]，但當(dāng)負菌占比再增加時，產(chǎn)量及生物量都呈下降趨勢。

2.1.2 發(fā)酵時間對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響

在不同的發(fā)酵時間下，菌體的生長情況存在差異。發(fā)酵時間對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響見圖2。

由圖2所示，B.trispora在96 h后開始大量合成β-胡蘿卜素，發(fā)酵生物量也不斷增加，在132 h時，β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量達到最大值。由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的消耗，132 h后兩者不再增加，在該時間點后產(chǎn)量與生物量都有所下降，這可能是因為菌絲發(fā)生自溶。綜合考慮菌體生長及產(chǎn)物的合成情況將132 h作為發(fā)酵的終點。

圖2 發(fā)酵時間對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響Fig.2 Effects of fermentation time on yield and fermentation biomass of β-carotene

2.1.3 接種量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響

接種量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響見圖3。

圖3 接種量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響Fig.3 Effects of inoculation amount on yield and fermentation biomass of β-carotene

由圖3所示，隨著接種量的不斷增加，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量及發(fā)酵生物量也逐漸增加。由此可知，增加接種量有利于產(chǎn)量及生物量的提高，但在接種量超過12.5%后β-胡蘿卜素的產(chǎn)量以及生物量都有所下降，可能是因為接種量過大，導(dǎo)致錐形瓶中菌絲生長數(shù)量過多，發(fā)酵液黏度增大，影響發(fā)酵基質(zhì)的傳氧速率，從而造成溶氧量的不足[16]，使得β-胡蘿卜素的產(chǎn)量降低。

2.1.4 發(fā)酵液初始pH值對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響

發(fā)酵液初始pH值對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵液初始pH值對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響Fig.4 Effects of initial pH of fermentation broth on yield and fermentation biomass of β-carotene

pH值對于微生物的生長以及產(chǎn)物生成的影響是不可忽視的。pH值的變化會影響菌體內(nèi)部酶活、細胞結(jié)構(gòu)以及對培養(yǎng)基的利用速率，從而影響菌體的生長以及產(chǎn)物的合成[17]。Choudhari等[18]研究了初始 pH 4～10的培養(yǎng)基對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明在pH 6～7之間獲得較高的產(chǎn)量。從圖4可以得到，本試驗采用的B.trispora的最適生長pH值在6.75左右，在該pH值條件下β-胡蘿卜素產(chǎn)量以及生物量都比較高，pH值偏大或偏小對菌絲生長及β-胡蘿卜素的合成都不利。因此，在發(fā)酵過程中應(yīng)該嚴(yán)格控制發(fā)酵液的初始pH值。

2.1.5 植物油添加量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響

植物油中主要成分為甘油三酯，B.trispora能分泌脂肪酶水解植物油，水解產(chǎn)物可以為β-胡蘿卜素的合成提供前體物質(zhì)——乙酰輔酶A[19]。同時，植物油可以溶解發(fā)酵液中脂溶性的β-胡蘿卜素，并與水相分離，減少發(fā)酵液中產(chǎn)物的抑制作用，從而提高了β-胡蘿卜素的產(chǎn)量[20]。本次試驗對植物油添加量的影響研究結(jié)果見圖5。

圖5 植物油添加量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響Fig.5 Effects of vegetable oil on yield and fermentation biomass of β-carotene

由圖5根據(jù)未添加植物油與添加植物油的β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的對比發(fā)現(xiàn)，添加植物油的影響顯著，當(dāng)植物油添加量達到2%時色素產(chǎn)量達到最大，繼續(xù)添加植物油后，色素產(chǎn)量及生物量都有逐漸下降的趨勢，可能是由于過量的植物油改變了細胞膜的通透性[21]。因此，試驗菌種在植物油添加量為2%時對菌絲生長及β-胡蘿卜素的合成都比較有利。

2.1.6 VB1添加量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響

VB1添加量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響見圖6。

圖6 VB1的添加量對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及發(fā)酵生物量的影響Fig.6 Effects of on β-carotene yield and fermentation biomass

本試驗對VB1添加量的影響進行研究，由圖6發(fā)現(xiàn)VB1的添加對β-胡蘿卜素產(chǎn)量及生物量有一定的影響，當(dāng)VB1添加量達到0.001%時，色素產(chǎn)量及生物量達到最大，繼續(xù)添加VB1對其結(jié)果影響不大，考慮成本問題可以得出該試驗菌種在VB1添加量為0.001%時對發(fā)酵生物量及β-胡蘿卜素的合成都有利。

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件

在單因素試驗結(jié)果上，選擇影響最大的3個因素：pH 值（6.50、6.75、7.00）、接種體積比（1 ∶1、3 ∶2、2 ∶1）、植物油添加量（0.00%、2.00%、4.00%），設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，將β-胡蘿卜素的產(chǎn)量作為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 2 Response surface experiment design and results

對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行結(jié)果分析，得到二次多項回歸方程如下：

Y=496.02+7.86A+41.43B+29.80C-6.05AB+4.25AC+7.19BC-201.21A2-97.90B2-8.12C2

此模型可以預(yù)測B.trispora液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的最大產(chǎn)量，以及發(fā)酵的最大生物量。其中Y表示β-胡蘿卜素產(chǎn)量（mg/L），A、B、C 分別表示pH 值、接種體積比、植物油添加量。

2.2.1 β-胡蘿卜素產(chǎn)量結(jié)果方差分析

β-胡蘿卜素產(chǎn)量結(jié)果方差分析見表3。

表3 β-胡蘿卜素產(chǎn)量結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of β-carotene yield results

由表3可知，模型的F值是48.66且與其相關(guān)的P值小于0.000 1，該結(jié)果意味著此模型非常顯著。其中決定系數(shù)R2=0.984 3，意味著該模型與試驗值擬合較好，98.43%的數(shù)據(jù)都可以由該模型解釋[22]。根據(jù)上表的數(shù)據(jù)可以分析得出接種體積比的影響最大，植物油添加量其次，pH值的影響最小。從表中P值可以分析得出B、C、A2、B2對Y值的影響是極顯著的，說明試驗中各種影響因子對β-胡蘿卜素的產(chǎn)量不僅僅只是簡單的一元函數(shù)關(guān)系，其中平方項對產(chǎn)量也有很大的影響，且每個影響因素之間的交互作用對β-胡蘿卜素產(chǎn)量也有一定的影響。

pH值、接種體積比和植物油添加量的交互作用對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響見圖7。

圖7 pH值、接種體積比和植物油添加量的交互作用對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.7 Interaction of pH，inoculation volume ratio and vegetable oil addition amount on β-carotene yield

根據(jù)響應(yīng)面圖7可以看出，接種體積比和植物油添加量的交互作用對產(chǎn)量影響較大，pH值和接種體積比、pH值和植物油添加量的交互作用對產(chǎn)量影響較小，這與回歸方程所顯示的結(jié)果相同。

2.2.2 最優(yōu)條件的確定與驗證

通過響應(yīng)面軟件對方程進行求解，進而得到B.trispora液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的最佳工藝條件為：pH 6.77、接種體積比1.62∶1、植物油添加量4%，根據(jù)上述分析并結(jié)合實際試驗操作條件，將提取條件改為：pH 6.80、接種體積比1.60∶1、植物油添加量4%，在此條件下β-胡蘿卜素的理論產(chǎn)量為523.689 mg/L。根據(jù)上述條件進行驗證試驗，通過3次平行試驗得到β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為523.75 mg/L，較理論值高出0.23%，結(jié)果較為理想。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件參數(shù)很精確，具備實際參考意義。

3 結(jié)論

通過單因素試驗確定B.trispora產(chǎn)β-胡蘿卜素的搖床發(fā)酵條件：負正菌種接種體積比3∶2，發(fā)酵時間132 h，發(fā)酵液初始 pH 6.75，接種量 12.5%，VB1添加量0.001%。對單因素試驗進行分析找到影響因素最大的3個因素（pH值、接種體積比、植物油添加量）進行響應(yīng)面試驗，得到了該試驗的最佳條件：負正菌接種體積比1.60∶1，發(fā)酵液初始pH 6.80，植物油添加量4%，在此條件下B.trispora產(chǎn)β-胡蘿卜素產(chǎn)量達到523.8 mg/L，比優(yōu)化前提高了19.9%。目前來看，三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究仍不夠成熟，工業(yè)化生產(chǎn)進程緩慢。菌種的退化，發(fā)酵過程的調(diào)控及代謝機理，未來仍需進一步研究。