袁源，劉洋洋，龔霄，周偉，李積華，*

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524001；2.海南省果蔬貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524001）

檳榔（Areca catechu L.），為棕櫚科檳榔屬常綠喬木檳榔的果實(shí)。別名檳榔子、大腹子、橄欖子、青仔等，有“洗瘴丹”之稱，在我國(guó)主要分布于海南省。其用途廣泛，主要用于食用，在亞洲的許多地區(qū)，均有嚼食檳榔的習(xí)慣[1-2]。檳榔主要食用部位是檳榔果皮（pericarpium arecae，PA），約占果實(shí)三分之二以上的重量，又名大腹皮、檳榔衣、檳榔殼等[3-4]。作為理氣藥，揮發(fā)性成分是檳榔果皮中主要活性成分。揮發(fā)性化合物是評(píng)價(jià)中藥理氣藥質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，揮發(fā)性成分不僅作為其藥理基礎(chǔ)，還直接影響加工品的感官品質(zhì)[5]。

由于植物揮發(fā)性組分非常復(fù)雜，無(wú)法逐個(gè)組分采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比鑒定，而且各儀器性能和分離柱的柱效差異明顯，組分分離效果大有不同，這對(duì)質(zhì)譜產(chǎn)生許多干擾因素，而且其中的同分異構(gòu)體化合物因結(jié)構(gòu)相似，質(zhì)譜圖差別小。因此，僅選用質(zhì)譜檢索高匹配度來(lái)確定相應(yīng)峰組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)存在極大不確定性。保留指數(shù)（retention index，RI）是化學(xué)物質(zhì)在相應(yīng)類型分離柱中對(duì)應(yīng)正烷烴的一種比較穩(wěn)定的性質(zhì)。只要用于分離的色譜柱性質(zhì)相同，色譜條件相近，同組分在不同儀器上所得RI值通常為常數(shù)。因此，同時(shí)考慮質(zhì)譜匹配度和RI匹配度可極大提高鑒定準(zhǔn)確性。在揮發(fā)性復(fù)雜組分鑒定中，該方法在國(guó)際上得到普遍認(rèn)可并大量使用[6-8]。

以往涉及檳榔果皮揮發(fā)性成分的研究，僅僅使用質(zhì)譜檢索進(jìn)行簡(jiǎn)單定性以及面積歸一化法進(jìn)行簡(jiǎn)單相對(duì)定量[9-10]，為了更客觀的評(píng)價(jià)干制溫度與時(shí)間對(duì)檳榔果皮揮發(fā)性成分的影響，本研究采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（headspace-solid phase micro extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）結(jié)合保留指數(shù)RI進(jìn)行分析，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器、試劑

1.1 試驗(yàn)材料

檳榔青果：廣東省湛江市越泰試劑儀器公司采購(gòu)，經(jīng)除雜、洗凈、除核留皮備用。原植物標(biāo)本經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所李積華研究員鑒定確認(rèn)為棕櫚科植物檳榔（Areca catechu L.）。

1.2 儀器與試劑

GCMS QP2010-Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、AOC-5000三合一自動(dòng)進(jìn)樣器、GCMS Real Time Analysis色譜工作站：日本島津公司；SPME萃取頭divinylbenzene-carboxen-polydimethylsiloxane（DVB/CAR/PDMS）（50/30 μm）：美國(guó) Supelco公司。

α-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品、正己烷、甲醇（均為色譜級(jí)）：德國(guó)Sigma公司；正構(gòu)烷烴（C7～C30）標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó) Supelco公司。其余試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 檳榔果皮樣品的制備

同批檳榔果皮分為5個(gè)部分，一部分（50 g）為不做任何處理的鮮品（A），粉碎備用；余下4部分（各50 g）分別經(jīng) 40℃，6 h（B）、60℃，4 h（C）、80℃，2 h（D）、100℃，1 h（E）烘干至水分低于10%，粉碎備用。

2.2 固相微萃取條件

萃取頭在使用前，預(yù)老化1 h。分別稱取A 4.0 g，B～E 1.0 g，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液（α-蒎烯 900 μg/mL）100 μL置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中。首先將進(jìn)樣瓶放置在90℃溫度控制攪拌器中以250 r/min轉(zhuǎn)速動(dòng)態(tài)平衡10 min；再在上述條件下將萃取頭插入進(jìn)樣瓶動(dòng)態(tài)萃取20min；然后GC-MS進(jìn)樣，解吸溫度250℃，解吸時(shí)間5 min，平行進(jìn)樣3次。

2.3 GC-MS條件

GC條件為色譜柱：Rtx-5ms毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：70 ℃保持 2 min，以10℃/min升至130℃，保持2 min，再以15℃/min升至280℃，保持 2 min；進(jìn)樣口溫度 280℃；載氣（He）流速1 mL/min；壓力57.4 kPa；不分流進(jìn)樣。

MS條件為電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度230℃；接口溫度280℃；溶劑延遲3 min；數(shù)據(jù)采集方式Scan；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～550；檢測(cè)器增益電壓1.34 kV。

2.4 揮發(fā)性成分的定性與定量分析

式中：RI為被分析組分的保留指數(shù)；tx為被分析組分流出峰的保留時(shí)間，min；tn為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時(shí)間，min；tn+1為碳原子數(shù)為n+1的正烷烴流出峰的保留時(shí)間，min；tn＜tx＜tn+1。所得 RI值與文獻(xiàn)對(duì)應(yīng)物質(zhì)的保留指數(shù)相比較進(jìn)行定性分析。

式中：Ci為每個(gè)有效揮發(fā)性成分的相對(duì)含量，μg/g；Mi為待測(cè)物的質(zhì)量，μg；W 為樣品的去水干重，g；Ai和As分別為待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積；ms為加入內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，μg。

對(duì)每一個(gè)有效揮發(fā)性成分的相對(duì)含量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用分析軟件IBM SPSS Statistics 21進(jìn)行方差分析（ANOVA）和鄧肯多重比較法（Duncan′s Multiple Range Test）在p=0.05的水平下進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果以相對(duì)含量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 檳榔果皮干制后的揮發(fā)性成分定性分析

圖1表示的是檳榔果皮經(jīng)烘干后的揮發(fā)性成分的HS-SPME-GC-MS檢測(cè)總離子流圖。

圖1 烘干檳榔果皮的揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of the volatile components in dried PA

圖中數(shù)字標(biāo)注的色譜峰為經(jīng)過(guò)質(zhì)譜譜庫(kù)相似度匹配檢索和保留指數(shù)計(jì)算得到檳榔果皮的典型揮發(fā)性成分，與表1中列出的化合物一一對(duì)應(yīng)。所有這23種典型揮發(fā)性成分均先經(jīng)譜庫(kù)檢索，相似度大于88%，包括12種酯類、4種有機(jī)酸類、2種醛類、2種醇類、2種生物堿類和1種酮類，然后計(jì)算出每一種物質(zhì)的保留指數(shù)，并且與文獻(xiàn)中極性相似的色譜柱分離得到相同物質(zhì)的保留數(shù)值進(jìn)行比對(duì)，由于樣品測(cè)試條件差異，因此試驗(yàn)值與文獻(xiàn)值存在少許差異[11]。

3.2 檳榔果皮不同溫度時(shí)間干制后揮發(fā)性成分定量分析

表1列出了檳榔果皮經(jīng)不同溫度和時(shí)間干制至水分含量低于10%后，揮發(fā)性成分的相對(duì)含量的比較。

隨著干制溫度升高和時(shí)間增長(zhǎng)，揮發(fā)性成分的總含量呈遞減的趨勢(shì)，相對(duì)含量由1 128.46 μg/g降至730.82 μg/g～751.97 μg/g，中溫長(zhǎng)時(shí)（C）、中高溫中時(shí)（D）和高溫短時(shí)（E）所得揮發(fā)性成分含量間無(wú)顯著性差異，均對(duì)檳榔果皮揮發(fā)性成分有明顯影響。

3.2.1 酯類物質(zhì)

酯類物質(zhì)占檳榔果皮揮發(fā)性成分種類一半以上，相對(duì)含量占總體揮發(fā)性成分含量近半（51.55%）。周大鵬等[12]報(bào)道檳榔青果皮中的主要成分是醛類；與本次試驗(yàn)揮發(fā)性成分研究有所差別，其差別的主要原因有可能是選取的材料產(chǎn)地、成熟度不同等；胡延喜等[13]報(bào)道檳榔果皮揮發(fā)油中主要成分是有機(jī)酸類和酯類化合物，本次試驗(yàn)揮發(fā)性成分研究部分與此吻合，但由

于揮發(fā)性成分提取方式的不同，因此揮發(fā)性化合物種類與含量存在較大差異。C、D、E 3組的酯類總相對(duì)含量，顯著低于A、B兩組，組間無(wú)顯著差異；A、B兩組差異顯著，各組揮發(fā)性酯類化合物總體趨勢(shì)與總揮發(fā)性成分含量趨勢(shì)相同。檳榔果皮中的大部分揮發(fā)性酯類物質(zhì)含量隨干制溫度的上升呈下降趨勢(shì)，隨著溫度的升高，部分酯類物質(zhì)如反式油酸乙酯（21）、亞麻酸乙酯（22）等物質(zhì)甚至低于響應(yīng)無(wú)法檢出；然而1-甲基-1，2，5，6-四氫吡啶-3-羧酸甲酯（5）的相對(duì)含量呈現(xiàn)隨溫度升高而升高的趨勢(shì)，該化合物是檳榔堿（學(xué)名N-甲基-2，5，6-三氫吡啶-3-甲酸甲酯）的一種衍生物[14]，可能由高溫下檳榔堿受熱后所得；以及亞油酸乙酯（20）呈現(xiàn)隨加熱時(shí)間增加而降低的趨勢(shì)。

表1 干制檳榔果皮揮發(fā)性成分的定性鑒定結(jié)果及其相對(duì)含量Table1 Chemical content identified in the volatile components of dried PA

3.2.2 有機(jī)酸類物質(zhì)

有機(jī)酸類物質(zhì)各組之間差異顯著，總有機(jī)酸類化合物含量隨干制溫度的上升呈下降趨勢(shì)。張海德等[15]報(bào)道檳榔中含量較高的有機(jī)酸為肉豆蔻酸、油酸、亞油酸、棕櫚酸、月桂酸，本次試驗(yàn)揮發(fā)性成分研究部分相似，可能由于提取方式不同，種類存在一定差異。其中苯丙酸（8）和月桂酸（11）含量變化趨勢(shì)與總有機(jī)酸類趨勢(shì)相同，差異顯著；肉豆蔻酸（13）的相對(duì)含量呈現(xiàn)隨溫度升高而升高的趨勢(shì)，但在60℃以后的含量差異不顯著；棕櫚酸（17）的相對(duì)含量呈現(xiàn)受熱即降低的現(xiàn)象，但組間差異不顯著。

3.2.3 醛類和醇類物質(zhì)

醛類和醇類物質(zhì)各組總含量和單物質(zhì)含量之間差異顯著，均呈現(xiàn)隨干制溫度上升而含量下降的趨勢(shì)。

3.2.4 生物堿類物質(zhì)

目前生物堿類物質(zhì)被認(rèn)為是檳榔主要生理活性成分，主要為檳榔堿等。何曉燕等[16]報(bào)道加熱對(duì)檳榔堿含量影響較大，加熱時(shí)間越長(zhǎng)，檳榔堿下降越多，本研究中所測(cè)得的檳榔堿（6）相對(duì)含量隨著加熱溫度升高而下降，這與文獻(xiàn)“經(jīng)火無(wú)力”、“急治生用、緩治略炒”[17]一致。在本研究中所測(cè)得的生物堿類揮發(fā)性物質(zhì)中除檳榔堿外還能檢測(cè)出高檳榔堿，然而大部分文獻(xiàn)并未對(duì)高檳榔堿等其它次要生物堿進(jìn)行報(bào)道。本研究中所測(cè)得的高檳榔堿（7）相對(duì)含量隨干制溫度升高而升高，高檳榔堿（C9H15NO2）較檳榔堿（C8H13NO2）多一個(gè)甲基，可能由于隨著溫度升高，檳榔堿發(fā)生甲基化的高溫轉(zhuǎn)化反應(yīng)，需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。李凱悅等[18]報(bào)道通過(guò)固態(tài)反應(yīng)模型高溫時(shí)美拉德反應(yīng)會(huì)抑制檳榔堿的去甲基化，溫度足夠高時(shí)有可能促進(jìn)檳榔堿的甲基化。揮發(fā)性生物堿類物質(zhì)總相對(duì)含量呈現(xiàn)的是加熱時(shí)間越長(zhǎng)含量下降的趨勢(shì)，鮮組（A）和高溫短時(shí)組（E）間無(wú)顯著性差異，與其他3組組間差異性顯著。

3.2.5 酮類物質(zhì)

各干制組與鮮組酮類物質(zhì)呈顯著性差異，但各干制組組間差異不顯著，加熱溫度和時(shí)間對(duì)此類揮發(fā)性酮類物質(zhì)均有影響，但影響不呈線性相關(guān)。

4 結(jié)論

頂空-固相微萃?。℉S-SPME）作為一種目前較為先進(jìn)的在線前處理技術(shù)，集采樣、萃取、富集、進(jìn)樣為一體，對(duì)揮發(fā)性類物質(zhì)有較好的收集，且無(wú)需溶劑提取，符合當(dāng)前綠色環(huán)保、快捷迅速的檢測(cè)發(fā)展方向。與氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）結(jié)合使用能夠?qū)崟r(shí)在線對(duì)食品加工過(guò)程中品質(zhì)和工藝進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)藥品處理過(guò)程中活性物質(zhì)和工藝進(jìn)行跟蹤。本研究通過(guò)在不同干制溫度下研究檳榔果皮的揮發(fā)性物質(zhì)，采用氣質(zhì)聯(lián)用的譜庫(kù)檢索相似度結(jié)合保留指數(shù)定性分析，該方法誤差小，能實(shí)現(xiàn)對(duì)檳榔果皮揮發(fā)性未知物質(zhì)的準(zhǔn)確定性，彌補(bǔ)常規(guī)氣質(zhì)聯(lián)用譜庫(kù)檢索定性方法的不足，提高分析準(zhǔn)確性，使定性結(jié)果更加客觀和可靠。

本研究中，通過(guò)鑒定得到23種典型的揮發(fā)性物質(zhì)，較以往的文獻(xiàn)能更準(zhǔn)確的定性，包括12種酯類、4種有機(jī)酸類、2種醛類、2種醇類、2種生物堿類和1種酮類，這些揮發(fā)性物質(zhì)賦予了檳榔果皮作為理氣藥的藥理特性。作為理氣藥，干制時(shí)間對(duì)檳榔果皮的相對(duì)影響要遠(yuǎn)小于干制溫度，因此在后續(xù)深入研究檳榔果皮的各種干制工藝中，應(yīng)考慮較低溫的工藝，因此，通過(guò)對(duì)檳榔果皮干制品揮發(fā)性物質(zhì)的準(zhǔn)確定性與相對(duì)定量，有利于對(duì)工藝整體進(jìn)行評(píng)價(jià)和判斷，并為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。